張 偉 李帆 丁文淵

（安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 安徽安慶 246052 ）

硒（Se）元素是由瑞典化學(xué)家Berzlius 于1817 年從生產(chǎn)硫酸的礦尾中發(fā)現(xiàn)。硒對(duì)生命健康有極其重要的作用，具有抗自由基、抑癌抗癌、延緩衰老、提高機(jī)體免疫力、解除重金屬中毒、維持正常繁殖等各種功能[1]，缺硒會(huì)引起多種疾病，比如克山病和大骨節(jié)病[2]。富硒的菌株能通過(guò)生物轉(zhuǎn)化把有毒的無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)變成無(wú)毒的有機(jī)硒，其具有成本較低、生物利用率較高、硒含量較高、對(duì)環(huán)境污染小等優(yōu)勢(shì)[3]。富硒益生菌同時(shí)具有發(fā)揮有機(jī)硒和益生菌的雙重生物學(xué)功能，用于人體補(bǔ)硒效果更好，又可改善人體的生理機(jī)能。

安徽省池州市石臺(tái)縣大山村是繼陜西紫陽(yáng)、湖北恩施之后的第3 個(gè)全國(guó)罕見(jiàn)的天然富硒村[4]。經(jīng)分析檢測(cè)，石臺(tái)大山村土壤平均含硒4.4 mg/kg，是普通土壤20 倍。研究[5]表明細(xì)菌對(duì)硒的耐受性與土壤中的可溶性硒含量和可交換態(tài)硒含量均呈顯著正相關(guān)。本次試驗(yàn)以石臺(tái)縣大山村土壤為采集樣本，擬篩選出富硒能力較高的益生菌，進(jìn)一步豐富富硒益生菌的研究，為下一步研究富硒益生菌制劑對(duì)小鼠腸道菌群的影響提供一定的基礎(chǔ)。

1?實(shí)驗(yàn)試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（杭州微生物試劑有限公司）；革蘭氏快速染色液 （珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；細(xì)菌微量生化鑒定管（廣東環(huán)凱生物科技有限公司）。

2?實(shí)驗(yàn)方法

2.1 于安徽省池州市石臺(tái)縣大山村4 處不同區(qū)域（分別在田地、山腳、山腰、山頂）采集富硒土壤樣本8 份，將樣本經(jīng)生理鹽水梯度稀釋后分別置培養(yǎng)箱37℃和28℃培養(yǎng)24 小時(shí)后，選取生長(zhǎng)旺盛、清晰的菌落進(jìn)行分離、純化得到若干株益生菌， ⑵將分離出的若干純菌株通過(guò)菌落特征，革蘭染色和明膠液化、接觸酶、糖發(fā)酵等生理生化實(shí)驗(yàn)初步鑒定菌種；

2.2 經(jīng)16S rRNA 確定生物學(xué)分類地位。

3?實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)培養(yǎng)、分離、純化，最終得到三株菌株，分別為C5a-28、C4a-28 和C6b-28。

3.1 分離菌株生物學(xué)特征

① C5a-28：菌落為長(zhǎng)絲狀，乳白色，表面不光滑；菌體長(zhǎng)桿狀，鏈狀排列，具芽孢，革蘭染色陽(yáng)性，如圖1；

② C4a-28：菌落圓形，表面光滑，淡黃色；菌體呈梭形，有芽胞，革蘭染色陽(yáng)性，如圖2；

③ C6b-28：，菌落圓形，表面粗糙，淡黃色；菌體呈桿狀，成對(duì)排列，有芽孢，革蘭染色陽(yáng)性，如圖3。

圖1 C5a-28

圖2 C4a-28

圖3 C6b-28

3.2 分離菌株生理生化反應(yīng)：見(jiàn)表1。

表1 分離菌株生理生化反應(yīng)

3.3 分離菌株16S rRNA 測(cè)序結(jié)果（圖4、圖5、圖6）。

圖4 C5a-28 菌株16S rRNA 測(cè)序結(jié)果圖

圖5 C4a-28 菌株16S rRNA 測(cè)序結(jié)果圖

圖6 C6b-28 菌株16S rRNA 測(cè)序結(jié)果

4?總結(jié)

通過(guò)生理生化試驗(yàn)和16S rRNA 測(cè)序結(jié)果顯示，C5a-28 是假真菌樣芽孢桿菌，C4a-28 是賴氨酸芽孢桿菌，C6b-28 是芽孢桿菌，以上三種都是土壤中常見(jiàn)的益生菌。對(duì)多種有害微生物能發(fā)揮抑制作用，對(duì)人體腸道的微環(huán)境有改善作用，治療腸道菌群失調(diào)癥，能降解環(huán)境中的有毒物質(zhì)，在污水處理中也能發(fā)揮清除有害物質(zhì)的作用[6-8]。通過(guò)此次試驗(yàn)篩選出的益生菌，可以作為富硒菌的選用菌種，為下一步富硒及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠生理活性的影響奠定基礎(chǔ)。