蘇杰，楊馥宇，黃帥，田華

作者單位：1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，河北 唐山063000；2邯鄲市第三醫(yī)院眼科，河北 邯鄲056000

青光眼是一種以視神經(jīng)萎縮和視野缺損為共同特征的一種疾病，與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGCs）的死亡或凋亡密切相關(guān)［1］。但RGCs死亡或凋亡的機制如何，至今仍是人們討論的焦點，尋找一種有效防止RGCs死亡或凋亡的藥物至關(guān)重要。胰激肽原酶在體內(nèi)以酶原形式存在，可以作用于激肽原釋放出激肽，具有擴張血管、改善血液循環(huán)、降低血壓等作用［2］，還可以改善視網(wǎng)膜微循環(huán)，減輕視網(wǎng)膜缺血缺氧狀態(tài)［3］，但是否可降低眼內(nèi)壓，延緩RGCs的凋亡？尹連榮、高健生［4］的研究表明黃芪對RGCs有保護作用，目前胰激肽原酶并無人探討。本實驗于2018年3—6月通過制作慢性高眼壓模型，給予腹腔注射胰激肽原酶，研究用藥后眼壓的變化、RGCs的凋亡情況，以及與細胞凋亡相關(guān)基因B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）的關(guān)系，以期為青光眼的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康SD大鼠30只，月齡范圍為2～3月，體質(zhì)量范圍為200～250 g，雌雄各15只，由華北理工大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0004，環(huán)境溫度：19～22℃，濕度：50%～60%，自由飲食飲水。實驗前已簽署華北理工大學(xué)動物實驗倫理審查表（編號：2018003）。造模前眼前節(jié)及眼底檢查均未見明顯異常，按隨機數(shù)字表法分為三組：空白組、模型組、治療組，每組10只。

1.2方法

1.2.1動物造模 用經(jīng)典的鞏膜靜脈燒灼法制作慢性高眼壓大鼠模型，方法：采用3%戊巴比妥腹腔注射全麻，右眼點用丙美卡因滴眼液3次，順上方角膜緣做放射狀切口，分離周邊筋膜及肌肉，使用加熱的彎曲針頭針對顳上、顳下以及鼻上象限3條上鞏膜靜脈予以燒灼處理，術(shù)后0.9%氯化鈉溶液沖洗。采用手持壓平式眼壓計監(jiān)測大鼠眼壓，眼壓≥23 mmHg為造模成功。造模成功1周后，治療組給予腹腔注射胰激肽原酶0.8 U（常州千紅藥業(yè)），藥物劑量換算依據(jù)體表面積換算法得出，而空白組、模型組給予腹腔注射等劑量0.9%氯化鈉溶液（0.2 mL），均每天1次，連續(xù)2周。

1.2.2RGCs蘇木精-伊紅（HE）染色 實驗結(jié)束后手術(shù)摘除眼球，眼球標本常規(guī)石蠟包埋，制備切片，入蘇木精水溶液染色，流水沖洗，70%和90%乙醇各脫水10 min，入伊紅染色2 min，純乙醇脫水，二甲苯透明，選擇中性樹膠封片處理，光鏡下觀察視網(wǎng)膜各層形態(tài)。

1.2.3Bcl-2、Bax免疫組化及DNA斷裂的原位末端標記法（TUNEL） 制備的切片按照Bcl-2、Bax免疫組化試劑盒說明書進行操作，切片經(jīng)過脫蠟，抗原修復(fù)，血清封閉，加一抗、二抗，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，復(fù)染，脫水，封片。觀察RGCs中各因子的表達。每只動物選取不連續(xù)的3張切片，于高倍顯微鏡（40倍）下選取2個視野（每個視野50 620 μm2），應(yīng)用Image-pro-plus軟件觀察光密度（OD）值。凋亡染色同樣按照TUNEL試劑盒說明書進行操作，高倍鏡下觀察凋亡細胞陽性細胞率。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)包進行統(tǒng)計，實驗結(jié)果以±s表示，組間整體比較進行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。三組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，P＜0.017為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1眼壓分析各組造模前眼壓穩(wěn)定（P＞0.05）。造模后模型組與治療組眼壓均升高，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），治療組用藥后眼壓稍有下降，但無臨床意義。見表1。

表1慢性高眼壓大鼠各組眼壓的變化/（mmHg，±s）

表1慢性高眼壓大鼠各組眼壓的變化/（mmHg，±s）

注：與空白組比較，aP＜0.01

組別空白組模型組治療組F值P值術(shù)后3周14.90±1.32 33.00±1.09a 30.09±2.52a 315.063 0.000鼠數(shù)10 10 10術(shù)前15.10±1.54 14.83±2.07 14.64±1.99 0.152 0.860術(shù)后1周15.44±1.02 32.85±2.06a 32.77±2.07a 355.429 0.000術(shù)后2周15.21±1.41 33.27±2.24a 31.68±2.20a 427.714 0.000

2.2各組大鼠視網(wǎng)膜HE染色情況正常大鼠的視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，各層細胞排列規(guī)整有序。模型組可見視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)有所變薄，RGCs排列不規(guī)則，分布紊亂，細胞數(shù)量減少、缺失，空泡形成。治療組RGCs排列較規(guī)整，數(shù)量輕度減少，可見少量空泡形成。

2.3各組大鼠RGCs TUNEL染色情況正常大鼠視網(wǎng)膜肉眼未見TUNEL陽性細胞，模型組可見大量的TUNEL陽性細胞染色，胞核呈深棕色，治療組也存在TUNEL陽性細胞，但數(shù)量較少且染色較淺。各組間凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見表2。

2.4各組大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2、Bax表達情況健康大鼠視網(wǎng)膜中存在少量的Bcl-2、Bax蛋白表達，模型組Bcl-2、Bax表達均有所增強，治療組較模型組Bcl-2表達升高，Bax表達下降。各組因子陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見表2。

表2 各組大鼠Bcl-2、Bax的表達與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGCs）凋亡情況/±s

表2 各組大鼠Bcl-2、Bax的表達與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGCs）凋亡情況/±s

注：Bcl-2為B細胞淋巴瘤/白血病-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白，TUNEL指DNA斷裂的原位末端標記法。與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

TUNEL/%0.301±0.535 23.192±2.100a 19.638±2.595ab 796.179 0.000組別空白組模型組治療組F值P值鼠數(shù)10 10 10 Bcl-2 0.421±0.589 15.180±3.326a 23.012±2.974ab 389.728 0.000 Bax 0.361±0.566 22.289±2.665a 17.409±2.777ab 525.331 0.000

3 討論

青光眼是世界上主要致盲眼病之一，主要原因是視神經(jīng)的不可逆損傷［5-6］，視網(wǎng)膜節(jié)細胞凋亡是視神經(jīng)損傷的主要方式［7］，視網(wǎng)膜內(nèi)5層僅由視網(wǎng)膜中央動脈（終末動脈）供血，較易發(fā)生缺血，而RGCs在缺血缺氧環(huán)境中極易受損，并且再生能力有限［8］，所以阻止或延緩RGCs的喪失是保護青光眼病人視功能的關(guān)鍵，抑制神經(jīng)節(jié)細胞凋亡對青光眼的救治有重要價值［9］。

胰激肽原酶屬于絲氨酸蛋白酶類，在生物體內(nèi)以酶原形式存在。它可作用于體內(nèi)激肽原釋放出激肽，激肽可以松弛平滑肌，擴張微血管，提高微血管內(nèi)血液流速，增加灌注，改善代謝及微循環(huán)，擴張血管的同時降低血壓，胰激肽原酶還可抑制血小板聚集，防止血栓形成，增加微血管交連，有利于側(cè)支循環(huán)建立，改善視網(wǎng)膜組織缺血缺氧狀態(tài)等［10-11］。胰激肽原酶目前主要應(yīng)用于改善糖尿病視網(wǎng)膜病變病人眼底微循環(huán)，青光眼病人暫無應(yīng)用報道。本實驗通過制作大鼠慢性高眼壓模型，腹腔注射胰激肽原酶，研究結(jié)果顯示：胰激肽原酶腹腔注射后，治療組眼壓較模型組有所降低，但未達到正常范圍（10～21 mmHg），眼壓無明顯臨床意義，眼壓下降原因考慮可能為激肽作用于血管壁，擴張房水靜脈，導(dǎo)致房水引流增多所致。但下降的眼壓是否對保護RGCs有所幫助，需進一步研究證實。

正常視網(wǎng)膜各細胞層結(jié)構(gòu)清晰，細胞排列有序。本實驗HE染色顯示：模型組RGCs排列稀疏、紊亂，細胞變性、凋亡，數(shù)量減少，空泡形成較多，而治療組用藥后RGCs形態(tài)明顯改善，損傷較輕，空泡細胞減少，說明胰激肽原酶腹腔注射后可以有效保護RGCs，修復(fù)損傷。

有研究表明，RGCs的凋亡受到多種基因調(diào)控，而Bcl-2、Bax對RGCs的凋亡起主要調(diào)控作用［12］。Bcl-2蛋白可以與一些細胞凋亡相關(guān)細胞結(jié)合，影響這些細胞的傳導(dǎo)通路最終達到抑制凋亡的目的［13］。它是一種抗細胞凋亡基因，可抑制細胞的凋亡，而Bax是促凋亡蛋白，與Bcl-2結(jié)合后封閉其活性，導(dǎo)致細胞凋亡［14］。免疫組化實驗結(jié)果顯示：模型組與治療組較空白組Bcl-2、Bax表達均增多，胰激肽原酶腹腔注射2周后，與模型組相比，治療組Bcl-2表達增加，Bax表達減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明胰激肽原酶可以上調(diào)抗細胞凋亡因子Bcl-2的表達，下調(diào)Bax促細胞凋亡因子的表達，從而實現(xiàn)抗細胞凋亡，因此，胰激肽原酶通過調(diào)控Bcl-2、Bax的表達可以達到保護RGCs的目的。

有研究表明，青光眼不管損傷機制是如何形成和發(fā)展，最后的結(jié)局即RGCs的凋亡，可應(yīng)用TUNEL技術(shù)來測定細胞凋亡的情況［15］。TUNEL染色是常用的觀察凋亡的實驗方法，正常大鼠RGCs層偶見凋亡細胞，本實驗結(jié)果顯示：空白組未見明顯凋亡細胞，模型組較治療組凋亡細胞增多，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，提示眼壓升高后可導(dǎo)致RGCs發(fā)生凋亡壞死，而胰激肽原酶腹腔注射對RGCs具有保護作用，減少凋亡。

綜上所述，胰激肽原酶可以改善視網(wǎng)膜微循環(huán)，輕度降低眼壓，上調(diào)促凋亡因子Bcl-2，下調(diào)凋亡因子Bax的表達，抑制RGCs凋亡，達到保護視經(jīng)節(jié)細胞的目的，為青光眼的進一步治療提供理論依據(jù)。