丁華勝 王永劍 黃忠毅

（南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518101）

心肌缺血再灌注損傷（MI/R）仍為臨床上最常見(jiàn)的病理生理過(guò)程。近年來(lái)研究證實(shí)，心肌缺血再灌注損傷機(jī)制中，自由基學(xué)說(shuō)與炎性反應(yīng)在MI/R發(fā)生發(fā)展中的重要性越來(lái)越受到重視。實(shí)驗(yàn)表明在急性MI/R時(shí)，血漿中脂質(zhì)過(guò)氧化物（LPO）增多，而心肌中的超氧化物歧化酶（SOD）因合成減少、被灌注液帶走以及消耗增加而減少，補(bǔ)充外源性的SOD可減輕氧自由基的損傷，從而降低致死性心律失常[1-2]。1973年，Coodwin等在牛胸腺中提取發(fā)現(xiàn)高遷移率族蛋白B1（HMGB1），HMGB1作為炎性介質(zhì)由壞死細(xì)胞被動(dòng)釋放或激活的免疫細(xì)胞主動(dòng)分泌至胞外[3]，并與其受體RAGE和TLR4結(jié)合，導(dǎo)致大量的炎性介質(zhì)釋放。從大量的研究資料中得到的數(shù)據(jù)分析，HMGB1在MI/R的過(guò)程中起到了一定的作用[4]。丹參酮ⅡA具有抑制心肌細(xì)胞肥大并保護(hù)心肌的作用，其機(jī)制可能與擴(kuò)張血管、清除氧自由基、促進(jìn)血液循環(huán)，進(jìn)而發(fā)揮抗心肌缺血的作用有關(guān)[5-7]。本文通過(guò)觀察丹參酮ⅡA在心肌中的作用以及觀察對(duì)HMGB1、IL-1β、SOD的影響，以期為臨床防治MI/R提供參考?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD雄性大鼠52只，體質(zhì)量210～270 g，全部購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：室溫（22±2）℃，濕度（55±5）%，12 h/12 h晝夜周期，自由飲水與進(jìn)食。適應(yīng)性飼養(yǎng)4 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試藥與儀器 1）藥物：丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液（上海第一生化藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31022558，2 mL︰10 mg）；戊巴比妥鈉（山東魯南制藥廠）。2）試劑：IL-1β ELISA試劑盒[博士德生物工程公司（武漢）]；SOD試劑（南京建成生物科技有限公司）；HMGB1兔多克隆抗體（英國(guó)abcam公司）。2）儀器：低溫高速離心機(jī)（Hitachi CF-5型，日本）；UV-2201型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；千分之一天平（METTLER公司）；顯微鏡（OLYMPUS）；動(dòng)物呼吸機(jī)（浙江大學(xué)動(dòng)物儀器廠）。

1.3 分組及造模 1）分組：實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、丹參酮ⅡA高、低劑量（16、8 mg/kg）組，各組均為13只。2）模型制備：根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]，將劑量為30 mg/kg的戊巴比妥鈉通過(guò)腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠仰位固定，氣管插管后接人工呼吸機(jī)，在第四肋間開(kāi)胸后，分離心包，暴露心臟后，將4-0絲線穿過(guò)左心耳下緣冠脈前降支起始部約3 mm處，在結(jié)扎線下置入乳膠管（φ0.15 cm），收緊結(jié)扎線后打結(jié)，阻斷40 min后松開(kāi)結(jié)扎線再灌注2 h。判斷MI/R模型成功標(biāo)志：結(jié)扎線后大鼠心電圖標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)聯(lián)顯示ST-T抬高，絲線放松后抬高的ST-T下降。

1.4 干預(yù)方法 1）假手術(shù)組：在左心耳下緣冠脈前降支起始部約3 mm處穿線后10 min腹腔注射液生理鹽水4 mL，再灌注2 h，不結(jié)扎冠脈。2）模型組：缺血前腹腔注射生理鹽水4 mL，心肌缺血40 min后，再灌注2 h。3）丹參酮ⅡA低劑量組：缺血前10 min，腹腔注射丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液溶液4 mL（制備方法：丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液8 mg/kg兌入生理鹽水配至4 mL）。4）丹參酮ⅡA高劑量組：缺血前10 min，腹腔注射丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液溶液4 mL（制備方法：丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液16 mg/kg兌入生理鹽水配至4 mL）。以上4組大鼠成功造模后2 h立即處死，采集血液與心臟標(biāo)本然后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè) 1）梗死心肌面積的測(cè)定：于再灌注2 h結(jié)束后立即結(jié)扎冠狀動(dòng)脈，在頸動(dòng)脈處注射伊文斯藍(lán)1.5 mL，隨后將心臟取下用緩沖液PBS進(jìn)行沖洗，將脂肪、心房、血管等無(wú)關(guān)組織丟棄，用濾紙把左心室水分去除后放置在冰箱（溫度-20℃）內(nèi)進(jìn)行冷凍處理。之后由心尖部向上將心臟切成厚度相等的5片，進(jìn)行TTC染色，未被藍(lán)染的為危險(xiǎn)區(qū)（AAR），白色為梗死區(qū)（IS），由此得出梗死面積的百分比（IS/AAR×100%）。2）血清指標(biāo)測(cè)定：再灌注2 h后，采集頸靜脈血液標(biāo)本，2 500 r/min離心處理15 min，取上層血清移至EP管內(nèi)，置于低溫冰箱（-20℃）內(nèi)，借助分光光度計(jì)，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活力；采用ELISA法檢測(cè)IL-1β的表達(dá)水平，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。3）免疫組化檢測(cè)HMGB1蛋白表達(dá)：通過(guò)隨機(jī)方式，每組選8只大鼠，取大鼠左心室缺血區(qū)，采用免疫組化檢測(cè)HMGB1蛋白表達(dá)，在光鏡下心肌細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色均質(zhì)顆粒為陽(yáng)性。每張免疫組化切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（400倍），利用Image ProPlus 5.0對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞染色的AIOD（平均積分光密度）值進(jìn)行求解，此值與HMGB1蛋白含量呈正比關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）表示。多組之間比較采用單因素方差分析，組間比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積比較 見(jiàn)表1。與模型組比較，丹參酮ⅡA高、低劑量組心肌梗死面積均顯著減?。ň鵓＜0.05）。

表1 各組心肌梗死面積及血清IL-1β水平比較（±s）

表1 各組心肌梗死面積及血清IL-1β水平比較（±s）

與模型組比較，?P＜0.05，?P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△P＜0.05。下同

組別假手術(shù)組模型組丹參酮ⅡA低劑量組丹參酮ⅡA高劑量組n 5 5 5 5心肌梗死面積（%）-35.71±3.49 31.29±3.01*28.16±3.27*IL-1β（pg/mL）126.43±23.34 489.54±103.76△431.02±65.27*△401.79±47.33*△

2.2 各組大鼠血清中IL-1β的表達(dá)比較 見(jiàn)表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL-1β的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。丹參酮ⅡA高、低劑量組血清IL-1β水平下降，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠心肌壞死區(qū)組織HMGB1蛋白水平及血清SOD水平比較 見(jiàn)表2，圖1。1）HMGB1蛋白水平：丹參酮ⅡA兩個(gè)劑量組HMBG1蛋白表達(dá)水平較模型組明顯下降，模型組則較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.05）。2）SOD水平：模型組SOD水平較假手術(shù)組顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，丹參酮ⅡA兩個(gè)劑量組SOD水平明顯增高（P＜0.05或P＜0.01），表明丹參酮ⅡA可增強(qiáng)SOD的活性。

表2 各組大鼠心肌壞死區(qū)組織HMGB1蛋白表達(dá)及血清SOD水平比較（±s）

表2 各組大鼠心肌壞死區(qū)組織HMGB1蛋白表達(dá)及血清SOD水平比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組丹參酮ⅡA低劑量組丹參酮ⅡA高劑量組n 8 8 8 8 HMGB1（AIOD）13.81±2.16 27.31±3.91△20.66±2.92*△17.69±2.84*△SOD（U/mL）94.37±18.36 47.60±10.54△58.33±14.16*△70.24±16.94**△

圖1 各組心肌組織免疫組化圖（400倍）

3 討 論

心血管疾病是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病，雖然血運(yùn)重建的方式對(duì)于挽救患者的心肌壞死和生命尤為重要，但再灌注本身能夠?qū)е氯毖孕募p害，心肌結(jié)構(gòu)破壞和細(xì)胞死亡，從而誘發(fā)進(jìn)一步的損傷，造成心功能的惡化。MI/R的機(jī)制復(fù)雜，炎性反應(yīng)、鈣超載、氧自由基等都在發(fā)病環(huán)節(jié)中起到了一定的作用，隨著炎癥性反應(yīng)的出現(xiàn)，大量的氧自由基和細(xì)胞因子導(dǎo)致了血管通透性的增加和水腫。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者通過(guò)觀察丹參酮ⅡA預(yù)處理保護(hù)MI/R損傷，發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA能減少炎性細(xì)胞因子的釋放，增加SOD的合成，減輕氧自由基的釋放，降低心肌梗死的面積，實(shí)現(xiàn)對(duì)心肌缺血再灌注的干預(yù)。

SOD作為機(jī)體內(nèi)主要的抗氧化酶-超氧自由基清除劑，其活性代表了組織清除自由基的能力[9]。本研究中，與假手術(shù)組比較，模型組SOD顯著減少，這是因?yàn)槿毖俟嘧⒅行募〉腟OD合成減少、消耗增加，甚至部分被灌注液帶走，說(shuō)明本文制作的心肌MI/R模型成功。與模型組比較，兩個(gè)丹參酮ⅡA組SOD活性均顯著升高，說(shuō)明高低劑量丹參酮ⅡA均能夠增強(qiáng)缺血再灌注心肌中的SOD活性、減輕自由基的損傷，對(duì)MI/R起到明顯的干預(yù)作用。

HMGB1主要在人體內(nèi)的一些重要臟器以及組織廣泛存在，比如心、肝、脾、肺、腎、腦等。除肝、腦組織中主要存在于細(xì)胞質(zhì)外，在大多數(shù)組織中HMGB1存在于細(xì)胞核。表達(dá)HMGB1的基因位置為染色體13q12，通過(guò)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程最終產(chǎn)生[10-11]。HMGB1通常調(diào)控炎癥反應(yīng)的方式有：1）對(duì)于一般的細(xì)胞來(lái)說(shuō)，部分出現(xiàn)凋亡的細(xì)胞會(huì)在被吞噬之前生成HMGB1，從而使自身消化，起到清除雜物的作用。2）在出現(xiàn)比較嚴(yán)重的炎癥時(shí)，較多的巨噬細(xì)胞參與了炎癥抵抗，吞噬細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生較多的HMGB1，促進(jìn)炎癥的惡化，加重病情發(fā)展。在心肌缺血再灌注損傷模型中，HMBG1與其受體結(jié)合參與了心肌缺血再灌注損傷過(guò)程并發(fā)揮重要作用[12-16]。本研究中，丹參酮ⅡA能夠明顯降低HMGB1的表達(dá)，此外本研究顯示丹參酮ⅡA干預(yù)還可以減少炎性因子IL-1β的表達(dá)并增加SOD的活性，保護(hù)了心肌缺血再灌注損傷，這些在高劑量組中效果更為明顯。

總之，丹參酮ⅡA能夠降低缺血梗死心肌組織中HMGB1及IL-1β的表達(dá)，增加SOD的活性，降低心肌梗死面積，在MI/R的進(jìn)程中起到一定的保護(hù)作用。