孫愉洪，王銘正，肖煒，張勝利，張毅

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京 100193；2.北京市畜牧總站，北京 100107）

在過去幾十年里，奶牛經(jīng)高強(qiáng)度選育，產(chǎn)奶性能持續(xù)提升，但與此同時，群體近交程度不斷增加，隱性有害基因快速擴(kuò)散風(fēng)險增大[1]。HH5是新近發(fā)現(xiàn)的一種荷斯坦牛隱性遺傳缺陷基因，美國農(nóng)業(yè)部最早通過全基因組標(biāo)記分析，將其定位于牛9號染色體[2]，后續(xù)深入研究揭示致病機(jī)理為9號染色體上長達(dá)138kb的DNA片段缺失，導(dǎo)致二甲基腺苷轉(zhuǎn)移酶1（TFB1M）基因丟失[3]。突變型純合個體因缺少TFB1M基因?qū)е潞颂求w功能障礙，最終造成該基因型的胚胎在妊娠60d左右死亡。HH5基因的共同祖先為1957年出生的加拿大著名公牛Thornlea Texal Supreme[3,4]，其基因在世界范圍內(nèi)廣泛擴(kuò)散，奶業(yè)發(fā)達(dá)國家已將HH5列為常規(guī)檢測的遺傳位點。

目前，HH5遺傳缺陷基因的檢測方法較為繁瑣或成本較高，如基于高分辨率溶解曲線的檢測方法[3]雖然可以準(zhǔn)確分型，但需要專門儀器和試劑盒，檢測成本很高。此外，有國外商業(yè)公司（如Neogen）也提供HH5檢測服務(wù)，但檢測周期較長。本研究通過測序發(fā)現(xiàn)HH5等位基因包含一段特異性序列，在此基礎(chǔ)上建立一種快速、簡便的篩查HH5遺傳缺陷基因攜帶者的新方法，并對北京郊區(qū)一個荷斯坦牛群進(jìn)行了檢測。

表1 HH5突變型和野生型等位基因Sanger測序引物信息

1 材料與方法

1.1 HH5突變型和野生型等位基因Sanger測序

1.1.1 樣本及DNA提取

利用中國農(nóng)業(yè)大學(xué)荷斯坦?；蚪M信息數(shù)據(jù)庫，依據(jù)經(jīng)單倍型推斷[2]的HH5基因型信息，挑選53頭荷斯坦公牛，其中野生型純合子46頭，HH5攜帶者7頭。基因組DNA提取自公牛凍精，采用高鹽法[5]。

1.1.2 引物設(shè)計及PCR條件

基于已知的HH5遺傳缺陷基因突變（138kb缺失）所在牛參考基因組（Bos taurus genome assembly UMD3.1）上的位置（BTA9：93.23～93.37Mb）[3]，提取該缺失片段前后兩個斷裂位點附近的參考基因組序列，設(shè)計特異性引物（表1）。

PCR反應(yīng)體系：總體積25μL，其中10×Buffer 2.5μL ，dNTP混合物（各2.5mmol/L）2μL，Taq酶（5U/μL）0.5μL，上下游引物（20μmol/L）各0.5μL，基因組DNA模板1μL（50ng），ddH2O補(bǔ)至25μ L。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；然后35個循環(huán)，94℃變性30s，60℃或55℃（表1）復(fù)性30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸7min。

1.1.3 PCR產(chǎn)物Sanger測序

Wild-head引物組合的PCR產(chǎn)物，利用下游引物HH5-1Rnew進(jìn)行測序；Wild-end引物組合的PCR產(chǎn)物，利用上游引物HH5-2F進(jìn)行測序；Mutant引物組合的PCR產(chǎn)物，利用內(nèi)部引物HH5mutF（5’-AAAATACTGG TTTGTTTTGC-3’）進(jìn)行測序。

1.2 荷斯坦牛HH5遺傳缺陷基因檢測方法

本研究設(shè)計采用等位基因特異性PCR對HH5進(jìn)行分型，優(yōu)化雙重PCR條件，在一個PCR體系中同時擴(kuò)增野生型等位基因和突變型等位基因。

1.2.1 樣本

從上述測序樣本中選取野生型和HH5攜帶者各2頭。

1.2.2 引物設(shè)計

通過Oligo6引物設(shè)計軟件（https://www.oligo.net/），基于上述測序獲得的野生型等位基因和突變型等位基因部分序列，結(jié)合參考基因組序列，設(shè)計等位基因特異性引物（圖1），引物序列及PCR產(chǎn)物長度見表2。

HH5-2F與HH5-2Rshort引物組合用于特異性擴(kuò)增野生型等位基因，HH5-1F與HH5-1mutRnew引物組合用于特異性擴(kuò)增突變型等位基因。

圖1 HH5突變型和野生型等位基因特異性PCR分型引物位置示意圖

表2 HH5突變型和野生型等位基因特異性PCR分型引物信息

1.2.3 PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)體系：總體積25μL，其中金牌Mix快速PCR預(yù)混液（內(nèi)含緩沖液、dNTP、Taq酶）（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司）22μL，4條引物（濃度均為10μmol/L）各0.5μL，基因組DNA模板1μL（約50ng）。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；然后35個循環(huán)，94℃變性30s，56℃復(fù)性30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸7min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測

制作濃度為2%的瓊脂糖凝膠，取PCR產(chǎn)物4μL點樣，在TAE緩沖液中110V電壓下電泳20min。

1.3 HH5攜帶率分析

從北京延慶某奶牛場，隨機(jī)采集372頭荷斯坦母牛血液樣本，采用天根DP318試劑盒（天根生化科技(北京)有限公司）提取基因組DNA。通過本研究建立的等位基因特異性PCR分型方法檢測HH5基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 HH5野生型及突變型等位基因序列

將Sanger測序獲得的野生型等位基因的部分序列與牛參考基因組（Bos taurus genome assembly UMD3.1）比對，確認(rèn)序列一致。比較突變型等位基因序列與野生型等位基因序列，發(fā)現(xiàn)突變型等位基因可以分為三部分，最前面部分（AACCATTCAA）對應(yīng)于野生型等位基因序列的前端，最后面部分（TTACA ATGAT）對應(yīng)于野生型等位基因序列的尾端，中間部分為1個9bp序列（TGATTACAA）（圖2）。

Wild type (left)為138kb缺失片段前端（3'端）斷裂位點附近的野生型等位基因序列，Wild type (right)為138kb缺失片段后端（5'端）斷裂位點附近的野生型等位基因序列，Mutant type為突變型等位基因序列。

圖2 HH5野生型及突變型等位基因Sanger測序結(jié)果示意圖

2.2 HH5等位基因特異性PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

HH5等位基因特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖顯示擴(kuò)增產(chǎn)物符合預(yù)期，野生型純合子僅出現(xiàn)一條209bp條帶，而攜帶者出現(xiàn)209bp和347bp兩種條帶（圖3），表明本研究設(shè)計的2對引物組合可以用于準(zhǔn)確鑒別荷斯坦牛是否攜帶HH5遺傳缺陷基因。

通過觀察電泳圖（圖3）發(fā)現(xiàn)，在目的條帶下方，各泳道都存在明顯的引物二聚體條帶，但不影響對基因型的判斷。

圖3 HH5等位基因特異性PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3 荷斯坦母牛群HH5攜帶率分析

在372頭荷斯坦母牛中，檢出12頭HH5攜帶者，攜帶率為3.23%。為了驗證分型結(jié)果準(zhǔn)確性，本研究對所有12頭攜帶者和5頭隨機(jī)挑選的非攜帶者進(jìn)行Sanger測序，結(jié)果與PCR分型的結(jié)果完全一致，證明本研究建立的等位基因特異性PCR分型方法的可靠性。

3 討論

過去20多年的時間里，在荷斯坦牛中已先后報道了多種遺傳缺陷基因，包括白細(xì)胞黏附缺陷（BLAD）[6]、脊柱畸形綜合征（CVM）[7,8]和短脊柱畸形綜合征（Brachyspina）[9]等。近年來，隨著奶牛全基因組標(biāo)記數(shù)據(jù)的積累，多種新的有害基因被鑒定出來，例如HH1～HH5[10～12]。HH5是當(dāng)前荷斯坦牛中一種常見的遺傳缺陷基因，在美國和德國牛群中頻率分別達(dá)到2.22%[12]和2.76%[13]。本研究在北京郊區(qū)372頭荷斯坦母牛中，檢出12頭HH5攜帶者，攜帶率為3.23%。盡管本研究樣本量較小，但顯示HH5已經(jīng)存在于我國牛群中，奶牛場需要關(guān)注其負(fù)面影響。

HH5缺陷基因的分子機(jī)理為9號染色體上138kb大片段缺失，造成二甲基腺苷轉(zhuǎn)移酶1（TFB1M）基因丟失[3]，本研究通過Sanger測序驗證了突變型與野生型的序列差異，并發(fā)現(xiàn)突變型除了缺失138kb大片段之外，還發(fā)生了1個9bp序列（TGATTACAA）的插入（圖2）。TFB1M基因?qū)τ诰€粒體中啟動蛋白翻譯至關(guān)重要，其主要功能是使位于線粒體12S rRNA 3'端發(fā)夾環(huán)的腺嘌呤殘留發(fā)生二甲基化，此過程對核糖體小亞基的合成和生物功能起決定性作用[14]。HH5呈常染色體隱性遺傳，缺陷型等位基因攜帶者表現(xiàn)正常，但若攜帶者公牛與攜帶者母牛之間交配，1/4后代為隱性純合子，可導(dǎo)致胚胎發(fā)育早期死亡。德國學(xué)者研究顯示，HH5缺陷基因純合子胚胎在發(fā)育56～90d之間死亡，風(fēng)險交配（母牛的父親及母牛的與配公牛均為攜帶者）較非風(fēng)險交配（均為非攜帶者）可導(dǎo)致青年牛和成母牛56d非返情率分別下降5.4%和8.9%[13]。以母牛一次流產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)損失200美元[12]測算，遺傳缺陷為奶牛繁殖帶來的負(fù)面效應(yīng)相當(dāng)可觀，因此亟需采取科學(xué)選配方法，避免因風(fēng)險交配導(dǎo)致的有害基因純合。

采用有效手段篩查有害基因攜帶者是科學(xué)選配的前提。本研究針對突變型和野生型等位基因的序列差異，建立了一種基于等位基因特異性PCR檢測方法，通過常規(guī)PCR反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳即可準(zhǔn)確分型（圖3）。與已報道的高分辨率溶解曲線的檢測方法[3]相比，具有簡便、易操作、低成本的優(yōu)點。此外，本研究通過引物設(shè)計優(yōu)化，實現(xiàn)兩對引物在同一個反應(yīng)體系中完成，大幅提高了檢測效率，為在我國奶牛場開展針對HH5缺陷基因的科學(xué)選種和選配提供了技術(shù)手段。