薄秀梅, 張榮麗, 徐 洲

(1.徐州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學生物實驗學分中心，徐州 221004；2.徐州醫(yī)科大學化學教研室，徐州 221004；3.徐州醫(yī)科大學江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，徐州 221004)

MEKK3(mitogen-activated protein kinase/extr acellular signal-regulated kinase kinase kinase 3)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的重要成員，可被一系列細胞外信號(如生長因子、細胞因子、環(huán)境應激等)激活[1]，通過磷酸化的三級酶促級聯(lián)反應參與炎癥調(diào)節(jié)、細胞生長及凋亡等生物學過程。其氨基酸序列包含 N-端 Phox1/Bem1p(PB1)結構域，C-端富含絲氨酸/蘇氨酸殘基的催化結構域(kinase, S-TKc)，內(nèi)含活化環(huán)(activation loop，T-loop)，誘導T-loop內(nèi)二聚物的形成可激活JNK、MAPK等，因此二聚化是激活MEKK3磷酸化的重要過程[2]。催化結構域中391位的賴氨酸Lys(K)是一個ATP結合位點，對于MEKK3磷酸化相應底物發(fā)揮激酶活性非常重要。磷酸化作用可使MEKK3蛋白結構發(fā)生改變，提高與底物的結合度，緩解催化區(qū)域位阻[3]，從而參與信號分子的活化及信號傳遞過程。

研究表明，MEKK3參與激活多種神經(jīng)相關的信號通路[4-6]，還與帕金森病的發(fā)生及神經(jīng)血管生成等神經(jīng)生理病理活動相關[6-8]。MEKK3與下游同樣具有PB1結構域的MEK5結合，并將其磷酸化，激活ERK5信號通路[5]。JNK通路是炎癥發(fā)生過程中重要的信號通路，而炎癥是介導神經(jīng)元壞死的重要因素[9]，MEKK3是如何介導JNK通路并誘發(fā)炎癥性神經(jīng)系統(tǒng)疾病目前尚無相關報道。該研究采用生物信息學方法分析比較了野生型MEKK3WT及突變型MEKK3K391M蛋白質結構和性質的差異，并檢測了其是否可以激活JNK以鑒定其活性，為研究MEKK3的相互作用分子及機制提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大腸桿菌DH5α、pCMV-Tag-2c、PC12細胞本實驗室提供；轉染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；抗β-actin、p-JNKs、JNK多抗為Sigma產(chǎn)品，異硫氰酸熒光素酶標記二抗(來源于鼠)為Sigma產(chǎn)品；Protein G PLUS-agarose(sc-2002)為SantaCruz產(chǎn)品；Tris堿，購自Sangon公司；胎牛血清及小牛血清購自Gibco BRL；硝酸纖維素(NC)膜，購自Boehringer Mannheim；各種電泳Protein Marker以及各種限制性內(nèi)切酶購自MBI公司；總RNA提取試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，免疫沉淀試劑盒購于上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與RT-PCR

根據(jù)Genbank中所報道人的MEKK3基因編碼序列(NM_203351)，用Primer 5.0軟件設計上下游引物，同時在預突變的位置設計一對互補堿基引物，并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。其引物的堿基序列如下:

FLAG-MEKK3WT-F′(P1):5′GTCAGAATTCCA ATGGACGAACAGGAGGCATTG 3′

FLAG-MEKK3WT-R′(P2): 5′GTCACTCGAGG TGAGAGCTCAGTACATGAGC 3′

FLAG-MEKK3K391M-F′(P3): 5′GAACTTGCTTCCATGCAGGTCCAATTTG 3′

FLAG-MEKK3K391M-R′(P4): 5′CAAATTGGA CCTGCATGGAAGCAAGTTC 3′

下劃線部分分別為EcoR Ⅰ酶切位點G/AATTC與XhoⅠ的酶切位點C/TCGAG。以PC12細胞為材料，提取總RNA，以此為模板用反轉錄試劑盒進行cDNA的合成，以cDNA為模板用引物(Pl、P2)經(jīng)RT-PCR擴增出長約1 896 bp的全長片段MEKK3。以反轉錄的cDNA為模板，用引物(P2、P3)和(P1、P4)經(jīng)RT-PCR擴增目的片段，獲得長約1 200 bp的上游片段和約700 bp的下游片段，用此片段與引物(P1、P4)經(jīng)重疊延伸PCR法擴增出長約1 896 bp的MEKK3K391M全長片段，取5 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。當RT-PCR擴增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)陽性擴增帶后，切下含目的基因的凝膠塊，進行PCR擴增產(chǎn)物的純化，純化后的產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純化效果。

1.2.2 構建重組質粒FLAG-MEKK3WT及FLAG-MEKK3K391M

將獲得的MEKK3及突變體目的基因片段和質粒(pCMV-Tag-2c)經(jīng)EcoR I和XholⅠ酶切，酶切片段在DNA連接酶作用下，連入pCMV-Tag-2c載體。產(chǎn)生連接產(chǎn)物：FLAG-MEKK3WT/K391M，取5 μL連接產(chǎn)物加入到制備好的感受態(tài)細菌DH5α中，將轉化后的200 μL細菌涂在含有相應抗生素的固體培養(yǎng)基上，孵育過夜。待細菌長出后，選取白色菌落在含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。提取質粒，篩選陽性重組子委托上海英俊生物技術有限公司進行DNA序列分析。

1.2.3 真核表達重組質粒在PC12細胞中的表達

取測序正確的陽性重組子轉染至PC12細胞，利用DNA中量制備試劑盒抽提需要轉染的質粒，電泳分析并將質粒最終濃度調(diào)至1 μg/μL，-20 ℃保存用于轉染。將PC12細胞傳代至60 mm一次性細胞培養(yǎng)皿中。將DNA和脂質體分別加入無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，混勻，靜置5 min后將DNA與脂質體混合，放置20 min，將已傳代的PC12細胞用1 mL無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基清洗一遍，加入DNA與脂質體混合物，再加入1 mL無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)4 h。4 h后，再加入2 mL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放入37 ℃、5% CO2孵育箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。20 h后，將培養(yǎng)基換成含10%小牛血清加藥或者不加藥的DMEM培養(yǎng)基。常規(guī)收集細胞，離心后保存于-20 ℃。

1.2.4 蛋白樣品制備及Western-blot免疫印跡分析

將轉染后的細胞用PBS收集，離心5 min，棄上清。加入適量含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液，超聲裂解，離心。收集上清一部分用1×SDS電泳樣品緩沖液煮沸變性，-20 ℃保存，另一小部分通過BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。取50 μg蛋白提取物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(電壓80 V，200 min)轉膜，封閉，PBST洗3次(5 min/次)，加一抗4 ℃孵育過夜，PBST洗3次(5 min/次)，加二抗25 ℃避光孵育2 h，PBST洗3次(5 min/次)，暗室曝光。

實驗參照本間智晴的方法設定馴化時間，主要測定放聲后魚群的聚集率（標志框內(nèi)魚尾數(shù)與總魚尾數(shù)的百分比）。以及放聲后魚群的反應時間和聚集時間。實驗馴化時間分為兩個階段，第一階段為先放聲60s，停止放聲60s，接著再放聲30s后投餌120s，總時間為270s；第二階段為先放聲90s，停止放聲60s，再放聲30s后投餌120s，總時間為300s。實驗天數(shù)為12d，每日馴化4次。投餌量參照佐藤靖的研究報告，1次投餌量為15.7g。

1.2.5 生物信息學比較分析

進入GenBank下載人源MEKK3的基因和氨基酸序列。用ProtParam分析MEKK3蛋白質理化性質及穩(wěn)定性;用ProtScale、TMHMM預測蛋白質的親/疏水性和跨膜區(qū);借助PredictProtien和Swiss-Model在線預測軟件對蛋白質的二級和三級結構進行預測分析，用Swiss-Pdb Viewer 3.7軟件分析定點突變對MEKK3三級結構的影響。PROVEAN[10]預測氨基酸替換對蛋白質生物功能的影響。

2 結果與分析

2.1 MEKK3蛋白的理化性質分析和預測

借助ProtParam軟件對MEKK3蛋白進行理化性質預測，并與MEKK3K391M進行比對。人MEKK3蛋白由626個氨基酸組成，相對分子質量約為71 kD，蛋白質等電點為9.02，說明MEKK3是堿性蛋白質。在哺乳動物網(wǎng)織紅細胞中預測的半衰期為30 h、酵母體內(nèi)大于20 h、大腸桿菌細胞內(nèi)大于10 h，不穩(wěn)定系數(shù)是59.97，高于40，根據(jù)不穩(wěn)定指數(shù)的判斷標準[11]，推測MEKK3為不穩(wěn)定蛋白。疏水性平均值為-0.699，表明是親水蛋白質。對MEKK3K391M進行預測，顯示相對分子質量不變;蛋白質等電點為8.95，與野生型蛋白大致相同;疏水性平均值為-0.690，點突變并未改變蛋白質親/疏水性；蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為59.47，雖然也高于40，但比野生型蛋白不穩(wěn)定值稍低。

2.2 預測與分析MEKK3WT與MEKK3K391M蛋白親/疏水性和跨膜區(qū)

使用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)對MEKK3WT蛋白進行親/疏水性分析，結果顯示，MEKK3WT蛋白親水性最強位點是289位的天冬酰胺(asparagine, N),分值為-3.144;疏水性最強的位點是576位的異亮氨酸(iosle ucine, I)，分值為1.889。MEKK3WT蛋白親/疏水肽鏈分布在整個序列中是親水蛋白。突變蛋白MEKK3K391M親/疏水性的最強位點均未改變，如圖1所示。用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)軟件對MEKK3WT蛋白進行跨膜區(qū)分析，結果顯示，MEKK3WT蛋白626個氨基酸殘基全部在膜外，不存在跨膜區(qū)域，突變體MEKK3K391M蛋白跨膜區(qū)與MEKK3WT蛋白一致，如圖2所示。

圖1 MEKK3WT與MEKK3K391M蛋白的親/疏水性

圖2 MEKK3WT與MEKK3K391M蛋白的跨膜區(qū)域預測

2.3 MEKK3WT與MEKK3K391M蛋白二級結構的預測和分析

PredictProtien(https://www.predictprotein.org/)在線預測MEKK3蛋白的二級結構，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有14個α-螺旋和17個β-折疊，α-螺旋和β-折疊的氨基酸比率分別為18.69%和14.38%。MEKK3K-391M的α-螺旋和β-折疊分別變?yōu)?3個和21個，在 3～418位點MEKK3蛋白形成4個螺旋區(qū)(3～18、66～76、99～106、403～417)，MEKK3K391-M蛋白形成3個螺旋區(qū)(3～17、66～76、402～418);在537～561位點MEKK3蛋白形成2個螺旋區(qū)(537～538、553～561)，MEKK3K391M蛋白形成3個螺旋區(qū)(555、557～558、560～560)；在607～616位點MEKK3蛋白只有1段螺旋(613～616)而MEKK3K391M分為2段螺旋(607、613～616)；在44～417位點，MEKK3蛋白形成5個β-折疊(44～49、55～58、81～87、99～106、403～417)，而MEKK3K391M形成9個(46～51、57～59、83～85、90～91、118～120、360～364、367～367、375～381、387～395)；MEKK3蛋白在590～616處形成4個β-折疊(590～592、594～602、607、613～616)，而MEKK3K391M沒有。二級結構分析顯示，兩者的蛋白結合位點有變化，MEKK3蛋白有13個蛋白結合位點，MEKK3K391M有17個蛋白結合位點，比MEKK3蛋白多了66、96、124～126、175、222、261、292～293、300、521位點，而少了22、34、173～174、364位點,如圖3所示。

○為兩者不同處

2.4 MEKK3WT與MEKK3K391M蛋白的結構域和三級結構分析

采用PROSITE(www.expasy.org/prosite)軟件預測分析MEKK3蛋白含有PB1結構域和蛋白激酶結構域(protein kinase domain)，PB1結構域含有80個氨基酸殘基(Asp44～Gln123)，蛋白激酶結構域含有261個氨基酸殘基(Trp362～Ala622)，蛋白激酶結構域中含有許多ATP結合位點，其中Leu368、Gly369、Gln370、Gly371、Ala372、Phe373、Gly374、Arg375、Val376組成核苷酸結合區(qū)域，Lys391為氨基酸與化學物質相互作用的位點，Asp489位點具有酶活性直接參與催化作用。MEKK3K391M蛋白Leu368～Val376無核苷酸結合功能，Met391位點不能與化學物質相互作用，具有酶活性的位點Asp489也無催化功能，如圖4所示。分析表明，Lys391突變?yōu)镸et391，該位點失去與化學物質的結合能力。

圖4 MEKK3WT與MEKK3K391M蛋白的結構域

2.5 MEKK3WT與MEKK3K391M蛋白三級結構的預測和分析

將MEKK3蛋白序列輸入蛋白三級結構在線預測平臺Swiss Model(https://www.Swissmodel.expasy.org/)后，對蛋白進行同源建模，如圖5(a)所示。進一步分析MEKK3蛋白的氨基酸序列與模型蛋白質相似性波形圖，預測結構的波形較穩(wěn)定且大部分的氨基酸殘基分值不低于0.6，該模型趨近真實情況，如圖5(b)所示。使用Swiss-Pdb Viewer 3.7軟件分析預測MEKK3蛋白三級結構空間位阻的變化。MEK-K3蛋白K391突變?yōu)镸391后，側鏈基團形成的氫鍵并無變化，但是靠近反應中心的原子側鏈占有的空間位置變大，增大了空間位阻，如圖6所示。利用PROVEAN(http://provean.jcvi.org/index.php)預測單一氨基酸替換對MEKK3蛋白質功能區(qū)的影響，設定閾值為-2.5，其準確度(balanced acurracy)達到77.9%。此時發(fā)現(xiàn)突變型K391M的得分(PROVEAN score)為-5.394，小于-2.5，表示該突變?yōu)橛泻ν蛔儭?/p>

圖5 MEKK3蛋白三級結構及其同源蛋白質相似性波形圖

□為突變位點在MEKK3三級結構中的位置；→表示 LYS391側鏈基團;→表示MET391側鏈基團

2.6 MEKK3相互作用蛋白分析

分析可知,與MEKK3相互作用的大部分是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成員，它們之間也存在緊密的相互作用關系。

圖7 MEKK3蛋白的相互作用

2.7 MEKK3WT和MEKK3K391M重組體構建

圖8 MEKK3和MEKK3K391M測序結果(部分)

以PC12細胞提取的總RNA為模板，用RT-PCR的方法獲得MEKK3全長cDNA，經(jīng)重疊延伸PCR獲得MEKK3K391M全長cDNA，構建重組質粒FLAG-MEKK3/K391M，篩選陽性重組子測序分析，2個重組子測序結果表明：FLAG-MEKK3與GenBank登記的序列完全一致；FLAG-MEKK3K391M成功將編碼391位賴氨酸(Lys)的密碼子AAG突變?yōu)榫幋a甲硫氨酸(Met)的密碼子ATG，與預期結果完全一致，測序結果(部分)如圖8所示。

2.8 MEKK3WT和MEKK3K391M在PC12細胞中的表達

轉染FLAG-MEKK3WT和FLAG-MEKK3K391M的PC12細胞，經(jīng)細胞裂解液處理，SDS-PAGE分離后，以抗MEKK3的抗體進行免疫印跡分析。結果表明，F(xiàn)LAG-MEKK3WT和FLAG-MEKK3K391M均得到高效表達，如圖9所示。

2.9 MEKK3WT和MEKK3K391M蛋白生物活性鑒定

將MEKK3WT和MEKK3K391M重組體轉染PC12細胞，提取細胞總蛋白，進行免疫印跡分析，結果表明，JNK蛋白表達在MEKK3組和MEKK3K391M沒有明顯變化，而P-JNK在MEKK3組的條帶明顯深于對照組和MEKK3K391M組。

而P-JNK含量在MEKK3K391M組與對照組中相差不大。結果表明，過表達MEKK3激酶能激活JNK，使JNK發(fā)生磷酸化反應，P-JNK含量升高。而MEKK3K391M失去活性，無法激活JNK，如圖10所示。

1為control(vector)；2為MEKK3WT；3為MEKK3K391M

1為control(vector)；2為MEKK3；3為MEKK3K391M

3 討論

利用生物信息學手段分析預測了MEKK3蛋白的理化性質及跨膜區(qū)，結果表明MEKK3是堿性、親水性蛋白質，MEKK3定點突變后其蛋白質親水性以及跨膜區(qū)未改變，而穩(wěn)定性有所增強。對MEKK3蛋白及突變體二/三級結構分析表明，MEKK3K391M中激酶活性位點的改變影響了α-螺旋區(qū)和β-折疊在蛋白質中的分布，同時該位點失去與化學物質結合的能力。MEKK3蛋白K391突變?yōu)镸391，靠近反應中心的原子側鏈占有的空間位置變大，增大了空間位阻，導致MEKK3與ATP結合的難度加大，從而無法呈遞磷酸基團催化相應的底物，MEKK3蛋白處于永久失活狀態(tài)。PROVEAN預測K391M的突變?yōu)橛泻ν蛔?。以上生物信息學分析預測表明突變后的MEKK3可能無法結合并催化相應底物，失去生物學活性。進一步研究發(fā)現(xiàn)與MEKK3相互作用的蛋白質大部分為絲裂原活化蛋白激酶家族成員，結合生物信息學分析推測其主要作用方式是磷酸化并激活相應蛋白底物，進行信號傳遞。隨后，利用分子生物學手段構建了MEKK3突變體MEKK3K391M，MEKK3可以激活JNK，產(chǎn)生P-JNK，而MEKK3K391M無法激活JNK。為進一步研究MEKK3在JNK通路中發(fā)揮的作用奠定了基礎。

作為一種蛋白激酶，MEKK3分子內(nèi)特殊位點的磷酸化是其行使功能的必要條件，大量研究證實，MEKK3存在多個磷酸化位點。Thr294位點的磷酸化可使14-3-3蛋白與MEKK3相互作用，從而抑制核轉錄因子NF-κB的激活[12]。在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的刺激下，Ser526位點可被磷酸化，誘導IL-6的產(chǎn)生[13]。Ser526是活化環(huán)內(nèi)一個自身磷酸化位點，其磷酸化作用可誘導NF-κB、ERK、JNK或p38的激活，而MEKK3K391M無法在此位點磷酸化，表明K391是MEKK3的活化關鍵位點[14]。在胚胎發(fā)育早期，內(nèi)皮細胞向間充質細胞轉換過程中MEKK3發(fā)揮了重要作用[15]，MEKK3K391M組間充質細胞的生成減少。同時，在外植體中檢測到，MEKK3K391M組細胞凋亡蛋白比對照組高兩倍，表明MEKK3K391M可促進細胞凋亡。MAPK信號通路被認為與炎癥調(diào)節(jié)、細胞生長及凋亡等生物學過程有關。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病(AD)，帕金森氏病(PD)中，神經(jīng)炎癥發(fā)揮了重要的作用[16]，用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)處理BV2細胞，腦組織特異性表達的microRNA-124顯著下降，過表達microRNA-124，MEKK3/NF-κB信號通路被抑制，引起小膠質細胞的活化，抑制神經(jīng)炎癥的發(fā)生[6]。在許多信號通路中，MEKK3可以與一些蛋白分子相互作用，形成復合體，在JNK信號通路中發(fā)揮重要作用。脂肪組織炎癥中，MEKK3與同樣具有PB1結構域的蛋白NBR1之間的相互作用形成信號復合物，激活JNK[17]。MEKK3與WDR62形成復合物并將其磷酸化，激活JNK，控制神經(jīng)系統(tǒng)的生成[8]。MEKK3是IL-1R-TLR4信號傳導通路中MyD88-IRAK-TRAF6復合物的必須信號傳導，在IL-1和LPS刺激下誘導產(chǎn)生NF-κB、JNK。在MEKK3基因敲除的小鼠胚胎成纖維細胞中，Toll樣受體8(Toll-like receptor8，TLR8)介導的NF-κB、ERK、JNK的激活完全被阻斷[18]，因此TLR8激活JNK需依賴MEKK3的活化。然而在神經(jīng)損傷性疾病中，MEKK3激活JNK通路涉及眾多蛋白，其底物蛋白需要進一步研究。

JNK作為炎癥反應的重要信號傳導通路對大腦中神經(jīng)元的凋亡或退化有重要影響[19]。在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，JNK被激活[20]，炎癥在缺血性腦卒中的發(fā)病機制中起著至關重要的作用，腦缺血時，受損血腦屏障內(nèi)的小膠質細胞和浸潤的巨噬細胞被激活。缺血性腦卒中后小膠質細胞M1/M2表型的調(diào)控對腦修復至關重要。用脂多糖刺激小膠質細胞，茴香醇(對甲氧芐醇，PMBA)可通過抑制NF-κB激活和JNK的磷酸化抑制炎癥因子以及修復腦缺血的炎癥損傷[21]。蘆丁通過調(diào)節(jié)新生大鼠海馬JNK和p38 MAPK通路，減輕異氟醚誘導的神經(jīng)凋亡[22]。JNK通路可以被許多蛋白分子調(diào)控，在阿爾茨海默氏癥轉基因小鼠模型中，JNK和p38通路可被Cdk5/Rac1蛋白激酶復合體調(diào)控[23]。因此，尋找JNK上游調(diào)控因子，抑制JNK信號通路對于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要的意義。

4 結論

MEKK3中Lys391的氨基酸置換引起了蛋白結構和功能的改變，表現(xiàn)在α-螺旋、β-折疊的數(shù)量和位置變化、結合化學物質和催化能力降低、側鏈基團空間位阻變大等，突變蛋MEKK3K391M與ATP結合的難度加大，從而無法呈遞磷酸基團催化相應的底物，失去生物學活性，隨后的活性鑒定實驗表明，野生型MEKK3可以激活JNK，而MEK-K3K391M不能。研究成果對于進一步探索在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中與MEKK3相互作用的蛋白以及MEKK3如何調(diào)控JNK信號通路提供實驗基礎，也將為神經(jīng)損傷性疾病的研究提供新的方向。