馬玲芳,張 亮,葉旭波,代曉華
(寧夏大學農(nóng)學院,寧夏 銀川750021)
銀柴胡為石竹科繁縷屬多年生草本植物銀柴胡(SterllariadichotomaL. var.LanceolateBge.)的干燥根,性微寒,味甘,有大毒,歸肝、胃經(jīng)。據(jù)歷版中國藥典記載,大約有400多年的藥用歷史,是制傳統(tǒng)中成藥烏雞白鳳丸的主要原料之一[1-2]。銀柴胡具有清虛熱、除疳熱之功效,用于陰虛發(fā)熱、骨蒸勞熱、小兒疳熱及癌癥引起的虛熱等癥[3];具有抗炎、治療過敏性疾病、擴張血管等作用[4-5]。銀柴胡生長區(qū)的海拔為1200~1500 m,年平均氣溫為7.9~8.8℃,多生長于干旱少雨的荒漠、半荒漠草原區(qū),極耐干旱、耐貧瘠、耐寒,忌澇[6]。我國野生銀柴胡主要分布在寧夏、內(nèi)蒙古、陜西以及甘肅等省毗鄰的干旱少雨的荒漠草原區(qū)域[7-9]。20世紀80年代后,寧夏作為中藥銀柴胡的道地產(chǎn)區(qū),野生銀柴胡人工種植引種研究首次獲得成功,目前人工種植面積是全國最大產(chǎn)區(qū),藥材質(zhì)量也得到同行業(yè)認可[9]。
近年來,隨著中藥材種植行業(yè)的快速發(fā)展,人工種植得以廣泛推廣,種子需求量越來越大,但市場上提供的種子混雜嚴重,種子質(zhì)量參差不齊,嚴重影響銀柴胡藥材的質(zhì)量與產(chǎn)量。目前,銀柴胡真?zhèn)舞b定[10]、生理抗旱性[11]、藥理成分[5, 12]、種子質(zhì)量[13]、無公害栽培[14]等方面均有研究,然而就不同種源銀柴胡抗旱性及主要活性成分方面的研究尚未見文獻報道。因此,本研究針對寧夏中部干旱帶種植區(qū)干旱雨水少,人工種植銀柴胡種子混雜、種源不清、藥材質(zhì)量差等問題,研究分析了13份采集于不同種植區(qū)的種源材料抗旱生理指標、藥材主要活性成分、產(chǎn)量等指標,旨在為干旱區(qū)銀柴胡人工栽培提供抗旱性較強的優(yōu)質(zhì)種源材料。
1.1.1 試驗地概況
試驗設(shè)在寧夏同心縣王團鎮(zhèn)旱作高效節(jié)水示范科技園區(qū),該地處于東經(jīng)105°59′,北緯36°51′,海拔1240~2625 m,年均溫8.6℃,年平均降雨量273 mm,屬中溫帶干旱、半干旱大陸性氣候。
1.1.2 試驗設(shè)計
試驗采用單因素隨機區(qū)組設(shè)計,13份種質(zhì)資源材料隨機排列。小區(qū)寬2.5 m,長3 m,面積為7.5 m2,行距50 cm,播深2 cm,播種密度32.98株/m2,田間管理項目水平與一般大田生產(chǎn)水平相同,三次重復(fù),試驗持續(xù)兩年。
1.1.3 試驗材料
本研究選用采自不同人工種植區(qū)的銀柴胡種質(zhì)資源13份(編號1~13),于2017年秋從不同種植地采集銀柴胡種子,于2018年4月28日種植于寧夏同心縣王團鎮(zhèn)旱作節(jié)水示范園區(qū)試驗田。于2019年7月22日采集植株葉片進行抗旱性生理指標測定,于2019年10月13日挖取根部用于主要活性成分及產(chǎn)量測定。所用材料和所有植株經(jīng)寧夏大學農(nóng)學院李曉偉教授鑒定均為石竹科植物銀柴胡(SterllariadichotomaL. var.LanceolateBge.)。其采樣地和種子編號見表1。
表1 不同種源銀柴胡采樣地及其編號
1.2.1 抗旱性生理指標測定
取各種源長勢一致植株進行測定,將植株健康葉片裝入密封袋,低溫冷藏帶回實驗室,稱取適量葉片用于生理生化指標的測定。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性采用NBT還原法[15]、過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性測定采用紫外吸收法[16]、膜透性測定采用相對電導率(Relative electric conductivity, REC)法[16]、過氧化物酶(Peroxidase, POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[15]、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)測定采用硫代巴比妥酸法[15]、脯氨酸(Proline, Pro)含量測定采用酸性茚三酮法[17]、可溶性蛋白(Soluble protein, SP)采用考馬斯亮藍法[16, 18],每個指標三次重復(fù)。
1.2.2 總黃酮含量測定
參照周麗[7]的方法。精密稱取真空干燥并過40目篩的藥材粉末25 mg于25 mL容量瓶中,加50%乙醇25 mL至刻度,室溫超聲提取1.5 h,過濾作為供試品。精密吸取供試品6.0 mL于10 mL試管中,先加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL,靜置5 min,再加10%硝酸鋁溶液0.3 mL,靜置5 min,最后加1 mol·L-1氫氧化鈉溶液2 mL,并用50%乙醇溶液定容至刻度,搖勻,放置6 min,于最大吸收波長353 nm處測定吸光度值。計算方法如下:
總黃酮相對含量(mg·g-1)=(C×V×N)/M
其中,C表示標準曲線查的待測液中活性成分含量濃度(mg·mL-1),V表示樣品提取液測定體積(mL),N表示稀釋體積倍數(shù),M表示試樣質(zhì)量(g)。
1.2.3 總皂苷含量測定
參照周麗[7]的方法。精確稱取真空干燥并過40目篩的藥材粉末0.05 g于10 mL帶有刻度的具塞試管中,加甲醇至刻度,超聲40 min,3500 r·min-1離心3 min,轉(zhuǎn)移上清液作為供試品。精確吸取供試品2 mL于具塞試管中,水浴揮干溶劑,先加入5 %香草醛-冰乙酸0.2 mL,搖勻,再加入60%硫酸溶液5 mL,搖勻后于60℃水浴加熱20 min,立即用冰水冷卻,于最大吸收波長523 nm處測定吸光度值。計算方法如下:
總皂苷相對含量(mg·g-1)=(m×V1)/(M×V2)
其中,m表示標準曲線查的待測液中總皂苷含量(mg),V1表示樣品提取液總體積(mL),M表示試樣質(zhì)量(g),V2表示樣品提取液測定用體積(mL)
1.2.4 產(chǎn)量測定
2019年10月13日挖取30 cm土層內(nèi)的銀柴胡根,用毛巾擦去根表面的土,每10根為一個重復(fù),用米尺測定根長(cm),用游標卡尺測定根粗(mm),三個重復(fù)的平均值為各種源銀柴胡的根長、根粗,用1/100電子天平稱量根重(g)。
采用SAS 9.4 對試驗數(shù)據(jù)進行分析,Microsoft Excel 2010繪制圖表,Origin 2018作圖,DPS 7.05作聚類分析。
利用隸屬函數(shù)法進行各指標隸屬函數(shù)值計算,再利用各指標隸屬函數(shù)值聚類分析綜合評價。計算公式為:
當該指標與抗旱性呈正相關(guān)時:R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)(1)
當該指標與抗旱性呈負相關(guān)時:R(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)(2)
式中:R表示各指標對應(yīng)的隸屬函數(shù)值;Xi表示第i個指標數(shù)據(jù);Xmax與Xmin分別表示第i個指標中最大值與最小值。
式中:D表示抗旱性度量值;Wi為第i個指標的權(quán)重。
2.1.1 不同種源生理指標比較
對比13個不同種源銀柴胡植株葉片的各個抗旱生理指標。由圖2可知,各抗旱生理指標不同種源間存在一定差異。CAT酶活性的平均值為283.29 U·(g·min)-1,最高值與最低值之間相差62.20%,差異性極顯著。種源4號CAT酶活性最高,為506.15 U·(g·min)-1,與其它種源CAT酶活性差異性顯著;其次是種源10號,與其他種源材料也呈顯著差異。種源13號CAT酶活性最低,為191.32 U·(g·min)-1,與其他種源差異顯著。種源2、3、5、7、9號之間差異不顯著,種源6、8、11、12號也不顯著。
SOD酶活性的平均值為234.68 U·g-1,最高值與最低值之間相差42.74%,差異性極顯著。種源10號SOD酶活性最高,為308.68 U·g-1,與其它種源差異性顯著;其次是種源3號,也與其他種源差異顯著;種源11號的SOD酶活性最低,為176.76 U·g-1,且與其他種源差異顯著;種源13、5號間差異顯著,也與其它種源差異顯著,種源7、2、1、12號之間差異不顯著,種源1、12、8、4號之間差異不顯著,種源6、9號之間差異也不顯著。
POD酶活性的平均值為820.19 U·g-1,最高值與最低值之間相差31.45%,差異性極顯著。種源12號的POD酶活性最高,為1031.26 U·g-1,12號與13號差異性不顯著,與其它種源差異性顯著;種源13號和6號POD酶活性次之,二者之間差異不顯著,但與其他種源差異顯著;種源1號POD酶活性最低,為706.94 U·g-1,但與種源2、4、8號之間無差異;種源5、11、7、10、9、3號之間差異不顯著。
MDA含量的平均值為32.48 mol·g-1,最高值與最低值之間相差49.56%,差異性極顯著。種源5號的MDA含量最高,為44.91 μmol·g-1,除和8號差異性不顯著,與其它種源MDA含量差異顯著;種源8號和10號的MDA含量居第二,二者之間差異不顯著,與其他種源差異顯著;種源3號MDA的含量最低,為22.65 μmol·g-1,除種源9號外,與其他種源差異顯著;種源10、1、4號之間差異不顯著,種源12、11、6、2號之間差異不顯著,種源13、7、9號之間差異也不顯著。
Pro含量的平均值為6.49 μg·g-1,最高值與最低值之間相差69.90%,差異性極顯著。種源4號Pro含量最高,為10.05 μg·g-1,與其它種源的Pro含量差異性顯著;其次是種源1號,除種源2號外,與其他種源差異顯著;種源12號Pro含量最低,為3.02 μg·g-1,與其他種源差異顯著;種源2、10、5、6號之間差異不顯著,種源6、8、3、7號之間差異不顯著,種源13、11、9號之間差異也不顯著。
圖1 不同種源銀柴胡抗旱生理指標Fig. 1 Drought resistance physiological indexes of different provenances of S. dichotoma 注:同一圖中不同小寫字母代表差異性顯著(P<0.001)。
可溶性蛋白含量的平均值為19.93 mg·g-1,最高值和最低值之間相差26.65%,差異性極顯著。種源13號可溶性蛋白含量最低,為16.68 mg·g-1,并與其它種源差異性顯著;其次是種源2號和4號;種源12號可溶性蛋白含量最高,為22.74 mg·g-1,與6號和9號無差異,與其他種源差異顯著;種源2、3、4、5、8、10和、11號之間無差異。
相對電導率的平均值為51.74%,最大值與最小值之間相差35.28%,差異性極顯著。種源10號相對電導率最小,為43.14%,與種源1、5、7、3、11、13號之間差異不顯著;其次是種源1號,為43.28%;種源9號相對電導率最大,為66.66%,與12號無差異,與其他種源差異顯著;種源6、4、2號之間差異不顯著,種源8、12號之間差異也不顯著。
2.1.2 不同種源抗旱性隸屬函數(shù)綜合評價
隸屬函數(shù)綜合評價值的大小反應(yīng)出各種源銀柴胡的抗旱性強弱,隸屬函數(shù)綜合評價值越高,抗旱性越強。本試驗對13份不同種源銀柴胡葉片內(nèi)的CAT活性、POD活性、SOD活性、MDA含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、相對電導率等的測定,結(jié)合多種生理指標,利用模糊隸屬函數(shù)評價法對各種源抗旱性進行綜合評價。由表2可知,13份不同種源銀柴胡的隸屬函數(shù)綜合評價值的大小即抗旱性強弱依次為:10號>4號>1號>5號>3號>2號>7號>8號>13號>6號>11號>9號>12號。再利用系統(tǒng)聚類法對各種源隸屬函數(shù)綜合評價值進行聚類,在歐距0.16處將13個種源的抗旱性分為強、中、弱3類,如圖2所示,抗旱性強的種源有10、4、1、5、3、2號,抗旱性中的種源有7、8、13、6、11號,抗旱性弱的種源有9號和12號。
表2 不同種源銀柴胡抗旱性綜合評價結(jié)果
圖2 銀柴胡不同種源模糊隸屬函數(shù)值的系統(tǒng)聚類圖Fig. 2 Systematic clustering of fuzzy membership function values of different provenances of S. dichotoma
由圖3 可知,13個不同種源銀柴胡之間總黃酮含量差異顯著(P<0.01)。各種源總黃酮平均含量為5.95 mg·g-1,最高與最低相差53.01%,含量高低依次為:1號>3號>12號>2號>4號>6號>7號>5號>13號>9號>11號>8號>10號;種源1號總黃酮含量最高,為8.19 mg·g-1,與3號無顯著差異,與其它種源差異性顯著(P<0.01);種源3號含量為7.45 mg·g-1,與種源1號相差1.09%;種源12號含量為7.13 mg·g-1,與種源1號相差13.01%;3號和12號之間無差異;種源10號總黃酮含量最低,為3.85 mg·g-1,但8、9、11、13號之間差異不顯著,與其他種源差異顯著。
圖3 銀柴胡不同種源總黃酮含量Fig. 3 Total flavonoids of S. dichotoma from different provenances
注:小寫字母a-f代表差異性,有相同字母的表示差異性不顯著(P<0.01)。
由圖4可知,13個不同種源銀柴胡總皂苷含量有顯著差異(P<0.05),各種源總皂苷平均含量為41.80 mg·g-1,最高與最低相差18.75%。各種源總皂苷含量高低依次為:12號>13號>2>11號>10號>3號>6號>4號>9號>5號>8號>1號>7號;12號總皂苷含量最高,為45.17 mg·g-1;其次為種源13號,為44.10 mg·g-1,與種源12號相差2.37%;第三為種源2號,為43.08 mg·g-1,與種源12號相差4.63%;種源7號總皂苷含量最低,為38.22 mg·g-1,且與5、8號之外的其他種源差異顯著;其他種源之間差異不顯著。
圖4 銀柴胡不同種源總皂苷含量Fig. 4 Total saponin content of S. dichotoma from different provenances
注:小寫字母a-e代表差異性,有相同字母的表示差異性不顯著(P<0.01)。
銀柴胡的根是目的收獲物,人工種植的銀柴胡2~3年根即可入藥,根的長度和直徑直接反映的是植株地下的生物量。如表3所示,不同種源銀柴胡根長沒有極顯著性差異,平均根長為20.54 cm,8號種源材料的根長最長為23.4 cm,與種源7、13、4、5、10、6、11號沒有顯著差異,且分別比平均值高13.74%、10.58%、9.11%、7.33%、4.33%、3.84%、1.98%、1.57%,與其它種源有顯著性差異(P<0.05);3號種源材料的根長最短為17.3 cm,與種源1、9、2、12號沒有顯著差異性,且分別比平均值低15.63%、10.59%、9.03%、8.68%、8.54%;不同種源銀柴胡根直徑?jīng)]有極顯著差異,平均直徑為6.49 mm,12號種源材料的根直徑最大為7.56 mm,與種源7、8、13號有顯著性差異(P<0.05),13號根直徑最細為5.55 mm,與7號和8號沒有顯著差異(P<0.05),與12號和9號有顯著性差異(P<0.05)。13份供試材料中,9號的根產(chǎn)量最高,為205 kg/667 m2,且除7、2、1號與其它種源材料沒有顯著差異(P<0.05),而1號的根產(chǎn)量最低,為0.180 kg/m2,除9、5、6、12號與其它種源沒有顯著差異(P<0.05)。產(chǎn)量、根長、根直徑相關(guān)性分析,產(chǎn)量與根直徑呈顯著正相關(guān)(P<0.05),相關(guān)系數(shù)為0.63,根直徑與根長呈極顯著負相關(guān)(P<0.01),相關(guān)系數(shù)為-0.68,銀柴胡在干旱地區(qū)生長,主要是通過根直徑大小的生長來增加產(chǎn)量。因此,就產(chǎn)量角度考慮,9、5、6、12號為高產(chǎn)種源材料。
表3 銀柴胡不同種源產(chǎn)量結(jié)果
注:小寫字母a-c代表差異性,有相同字母的表示差異性不顯著(P<0.01)。
表4為13份銀柴胡抗旱性指標、活性成分及產(chǎn)量的相關(guān)系數(shù)。從表中可以看出,產(chǎn)量與總黃酮含量呈不顯著負相關(guān),與總皂苷呈不顯著正相關(guān),與抗旱性指標SOD活性呈顯著負相關(guān)(P<0.05),與相對電導率呈顯著正相關(guān)(P<0.05);總黃酮含量與總皂苷含量呈不顯著負相關(guān),與抗旱指標MDA含量、相對電導率呈不顯著負相關(guān),與POD活性無相關(guān)性,與其它抗旱指標呈不顯著正相關(guān);總皂苷含量與POD活性呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與CAT活性、MDA含量、Pro含量、可溶性蛋白含量呈不顯著負相關(guān),與SOD含量、相對電導率呈不顯著正相關(guān);抗旱性指標POD與CAT、脯氨酸呈顯著負相關(guān)(P<0.05),CAT與脯氨酸呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。
表4 銀柴胡不同種源產(chǎn)量、活性成分及抗旱性指標相關(guān)系數(shù)
注:*代表顯著水平P<0.05;** 代表極顯著水平P<0.01
在干旱環(huán)境中,植物通過自身的生理生化及代謝調(diào)控途徑的相互作用來抵抗外界環(huán)境。SOD是植物細胞中最重要的清除活性氧的酶之一,植物通過提高SOD酶活性來減少氧自由基對細胞造成的損害,植物抗旱性強弱可用其活性變化來反映,輕度干旱環(huán)境中SOD含量呈波動性變化[19]。CAT和POD是細胞內(nèi)調(diào)節(jié)H2O2的重要的酶,將SOD酶反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2可被清除[19]。丙二醛含量是反應(yīng)植物膜傷害的一個指標,在干旱環(huán)境中丙二醛含量會相對升高,變化大則抗旱性強[7]。游離脯氨酸是植物受到逆境脅迫時的一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),保護植物遭受傷害,脯氨酸積累量與植物的抗逆性呈正相關(guān)[20]。干旱環(huán)境下,植物通過可溶性蛋白滲透調(diào)節(jié)適應(yīng)環(huán)境的改變,增強細胞的保水能力,對細胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護作用[21]。植物體內(nèi)積累的可溶性蛋白越高,細胞的滲透勢力就會越低[22]。當植物在干旱環(huán)境中時,葉片相對電導率值常作為衡量植物受害程度的指標之一,其值越小表示植物受害程度越高[23]。朗多勇[11]等研究結(jié)果表明,銀柴胡生理生化特性受土壤含水量的影響,隨著土壤含水量的降低,SOD和POD酶活性均逐漸降低趨勢,MDA含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,脯氨酸含量先下降后明顯升高,葉片膜透性呈逐漸下降趨勢,可溶性蛋白呈先增加后降低的趨勢,CAT酶活性在輕度干旱條件下略微降低或升高。據(jù)此,本研究對13份銀柴胡不同種源材料的7個抗旱生理生化指標根據(jù)隸屬函數(shù)D值進行抗旱性強弱排序:10號>4號>1號>5號>3號>2號>7號>8號>13號>6號>11號>9號>12號。利用系統(tǒng)聚類法對各種源隸屬函數(shù)綜合評價值進行聚類,在歐距0.16處將13個種源的抗旱性分為強、中、弱3類,如圖1所示,抗旱性強的種源有10、4、1、5、3、2號,抗旱性中的種源有7、8、13、6、11號,抗旱性弱的種源有9號和12號,篩選出較為抗旱的種源為種源10、4、1、5、3、2號。
中藥的活性成分含量是中藥質(zhì)量的內(nèi)在標準。銀柴胡的有效成分主要有黃酮類、皂苷類、甾體類、環(huán)肽類[4]等,其藥用價值具有良好的發(fā)展前景,銀柴胡黃酮類成分具有明顯的抗菌、抗病毒作用[24-25]。徐灼輝[26]等研究發(fā)現(xiàn),總黃酮含量是體現(xiàn)抗氧化能力的重要指標,荔枝中總黃酮含量越高其抗氧化能力越強。張子婷[27]等研究發(fā)現(xiàn),廣金錢草有效成分具有抗氧化,防治腎臟草酸鈣結(jié)石形成、利尿、保護心腦血管抗炎等功效。趙強[28]等研究發(fā)現(xiàn),魚腥草總黃酮具有抗氧化延緩衰老、抗腫瘤、抗輻射、抗過敏、抑菌性和抗疲勞作用。銀柴胡皂苷類成分具有抗動脈粥樣硬化作用[29]。趙英[30]等研究發(fā)現(xiàn),威靈仙總皂苷具有抗腫瘤作用。章蘊毅[31]等研究發(fā)現(xiàn)威靈仙總皂苷具有抗炎鎮(zhèn)痛作用。
本研究對13份銀柴胡不同種源材料的,比較分析了兩年生銀柴胡各個種源間總黃酮、總皂苷含量的高低。兩年生總黃酮含量在3.85~8.19 mg·g-1,且各種源間差異性顯著,種源1、3、12、2號總黃酮含量相對較高,若以總黃酮含量作評價標準,13份不同種源銀柴胡質(zhì)量較好的種源有1、3、12、2號;兩年生總皂苷含量在38.22~45.17 mg·g-1,且各種源間有差異性,種源12、13、2、11、10、3、6號總皂苷含量相對較高,若以總皂苷含量作評價標準,13份不同種源銀柴胡質(zhì)量較好的種源有12、13、2、11、10、3、6號。
本研究中各抗旱生理指標與產(chǎn)量的相關(guān)性分析結(jié)果表明,抗旱生理指標SOD活性與產(chǎn)量呈顯著負相關(guān),相對電導率與產(chǎn)量呈顯著正相關(guān),說明在干旱環(huán)境中,銀柴胡各生理指標協(xié)同作用,使植株維持相對穩(wěn)定的體內(nèi)環(huán)境,促進了產(chǎn)量的增加;藥材活性成分與產(chǎn)量無相關(guān)性;各抗旱生理指標與藥材活性的相關(guān)性分析結(jié)果表明,總黃酮含量與抗旱性無相關(guān)性,總皂苷含量與抗旱生理指標POD活性呈正相關(guān),說明銀柴胡中總皂苷含量受干旱環(huán)境的影響。
(1)13份不同種源銀柴胡材料抗旱性可分為3類:抗旱性強的種源有10、4、1、5、3、2號,抗旱性中的種源有7、8、13、6、11號,抗旱性弱的種源有9號和12號,篩選出較為抗旱的種源依次為10、4、1、5、3、2號。
(2)兩年生銀柴胡總黃酮含量在3.85~8.19 mg·g-1,且各種源間差異性顯著,種源1、3、12、2號含量相對較高;兩年生銀柴胡總皂苷含量在38.22~45.17 mg·g-1,且各種源間差異性不顯著,種源12、13、2、11、10、3、6號總皂苷含量相對較高。
(3)兩年生銀柴胡產(chǎn)量在120~205 kg/667 m2之間,且各種源間差異性不顯著,種源9、5、6、12號產(chǎn)量較高,根直徑是影響產(chǎn)量的主要因素。
(4)產(chǎn)量與總黃酮含量呈不顯著負相關(guān),與總皂苷呈不顯著正相關(guān),與抗旱性指標SOD活性呈顯著負相關(guān)(P<0.05);總黃酮含量與總皂苷含量呈不顯著負相關(guān);總皂苷含量與POD活性呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。
綜合各指標,種源2號和3號抗旱性強且主要活性成分總黃酮和總皂苷相對含量較高;種源12號產(chǎn)量高且主要活性成分總黃酮和總皂苷相對含量較高;種源5號抗旱性較強且產(chǎn)量較高,與其它種源差異性顯著。