王代鑫 徐升 程哲* 張振宇* 李海波

（1吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 吉林 132101；2 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，沈陽 110866；*通訊作者：740206904@qq.com；53347007@qq.com）

水稻原產(chǎn)于熱帶沼澤，是喜溫作物，易受低溫冷害。冷害是指植物在零度和滿足其生長需求的正常溫度之間的溫度范圍內(nèi)所引起的生長緩慢或者非正常發(fā)育的現(xiàn)象[1]。低溫會導(dǎo)致植物體內(nèi)蛋白質(zhì)變性，酶活性降低，細(xì)胞膜的流動性降低，膜脂過氧化，進(jìn)而使植物各種生理機(jī)能遭到破壞，嚴(yán)重則會導(dǎo)致植物死亡[2]。低溫冷害嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量提高和品質(zhì)改善，是我國稻作生產(chǎn)中的一大限制因子，是稻作生產(chǎn)中的一個(gè)世界性問題[3-4]。低溫冷害按水稻不同生育階段可分為育苗期冷害、插秧返苗期冷害、孕穗期冷害、抽穗開花期冷害和灌漿結(jié)實(shí)期冷害；又可分為營養(yǎng)生長期冷害和生殖生長期冷害，主要有延遲型冷害、障礙型冷害和混合型冷害[5]。水稻苗期耐冷性鑒定指標(biāo)包括形態(tài)指標(biāo)和生理生化指標(biāo)。形態(tài)指標(biāo)包括葉片萎蔫度、死苗率、葉片卷枯度和葉色褪綠程度等，其中最直觀的是死苗率，幼苗枯死是水稻不耐冷的最終結(jié)果[6]；生理生化指標(biāo)包括葉片相對電導(dǎo)率、根部電導(dǎo)率、脯氨酸含量、葉綠體色素含量、丙二醛（Malonic Dialdehyde，MDA）含量、電解質(zhì)滲透率（Electrolyte leakage，EI）、抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase, APX）及谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）含量等[7-9]。

吉林稻區(qū)低溫冷害發(fā)生頻率高[5]，而且對耐冷水稻品種的選育稍顯滯后。因此，本研究選取吉林省21 個(gè)中晚熟水稻品種（品系）為材料，通過測定水稻幼苗（3葉期）各項(xiàng)生理生化指標(biāo)在低溫處理前后的變化，對水稻苗期耐冷性進(jìn)行分析和評價(jià)，以為吉林省耐冷水稻品種（品系）選育提供理論依據(jù)和生產(chǎn)實(shí)踐支撐。

1 材料與方法

1.1 供試品種及藥劑

供試品種有：新科 32、吉大 17-03、吉香 6、鐵19、宏科 87、通 35、吉玉粳、廩實(shí) 698、吉宏 9、廩實(shí) 528、長白9、秋田小町、吉粳507、秋光、通禾16-8037、輝粳7、吉粳 515、鐵 06、宏科 67、吉粳 95、通科 27。

供試藥劑為：5%三氯乙酸（TCA）、0.67%硫代巴比妥酸（TBA）、95%乙醇、SiO2粉、CaCO3粉、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）測試盒、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定試劑盒。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2019 年在吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院進(jìn)行，將參試的21 個(gè)中晚熟水稻品種（品系）放置低溫脅迫條件下進(jìn)行處理。采用人工氣候箱法培養(yǎng)水稻幼苗；常溫（25℃）下培養(yǎng)20 d，然后低溫（5℃）處理3 d。分別測定常溫和低溫下水稻幼苗各項(xiàng)生理生化指標(biāo)。

圖1 不同溫度處理下MDA 含量的變化

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 MDA 含量

稱取水稻幼苗0.5 g，加入5% TCA 5 mL、少量SiO2粉，進(jìn)行研磨，所得勻漿離心（3 000 r/min）后取上清液2 mL 加0.67% TBA 水浴煮沸30 min，取上清液采用分光光度計(jì)法在450 nm、532 nm、600 nm 下測定吸光度，計(jì)算MDA 含量。

1.3.2 葉綠體色素含量

稱取水稻幼苗0.2 g，加入95%乙醇、少量SiO2粉和CaCO3粉，進(jìn)行研磨，再加入10 mL 95%乙醇，繼續(xù)研磨至組織變白，靜置3 min 后取濾紙1 張置于漏斗中，沿玻璃棒將提取液過濾到25 mL 棕色容量瓶中并定容，搖勻后利用分光光度計(jì)法在665 nm、649 nm、470 nm 下測定吸光度，用公式計(jì)算出幼苗提取液中各色素的含量。

1.3.3 APX 活性

稱取水稻幼苗0.2 g，加入少量SiO2粉研磨成勻漿，按說明書進(jìn)行測定。APX 能催化H2O2氧化抗壞血酸（AsA），通過測定AsA 氧化速率來計(jì)算APX 活性。

1.3.4 GPX 活性

稱取水稻幼苗0.5 g，加入少量SiO2粉研磨成勻漿，按說明書進(jìn)行測定。GPX 可以促進(jìn)過氧化氫（H2O2）與還原型谷胱甘肽（GSH）反應(yīng)生成H2O 及氧化型谷胱甘肽（GSSG），GPX 的活力可用其酶促反應(yīng)的速度來表示，測定此酶促反應(yīng)中GSH 的消耗，則可求出GPX 的活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻幼苗低溫處理前后幼苗MDA含量的變化

植物在逆境脅迫（如低溫、高溫、干旱、鹽漬、病蟲害、環(huán)境污染等）下，細(xì)胞膜會受到不同程度的傷害發(fā)生膜脂過氧化，導(dǎo)致MDA 含量會迅速增加。MDA 含量常作為衡量植物在逆境脅迫下受傷害程度的重要指標(biāo)，常通過測定MDA 含量來間接測定膜系統(tǒng)受損程度以及植物對逆境脅迫的抵抗能力。

如圖1 所示，經(jīng)過低溫（5℃）處理后，各水稻品種（品系）MDA 含量均明顯增加，含量較高的5 個(gè)品種（品系）是新科32、長白9、秋田小町、秋光、吉粳95，含量較低的5 個(gè)品種（品系）是宏科67、通禾16-8037、吉宏9、通科27、通35。單獨(dú)分析MDA 含量的變化不能充分分析說明各個(gè)品種（品系）對低溫的耐受能力。因此，通過計(jì)算不同溫度處理前后MDA 含量的變化，即處理效應(yīng)[（MDA 低溫-MDA 常溫）/MDA 常溫]則更能夠反映植物對低溫脅迫的響應(yīng)特征，處理效應(yīng)值越低表明低溫處理的效果越不明顯，則認(rèn)為水稻品種（品系）耐受低溫脅迫的能力越強(qiáng)。經(jīng)測定，處理效應(yīng)值較低即耐冷性較強(qiáng)的5 個(gè)品種（品系）分別是宏科67、通禾16-8037、通科27、宏科87 和輝粳7，可作為耐冷育種的親本；處理效應(yīng)值較高即耐冷性較弱的5 個(gè)品種（品系）分別是吉玉粳、鐵19、廩實(shí)698、吉粳507 和秋天小町，這些品種（品系）在栽培過程中，應(yīng)加強(qiáng)對低溫冷害的防御。

2.2 水稻幼苗低溫處理前后幼苗葉綠體色素含量的變化

圖2 不同溫度處理下葉綠素a 含量的變化

圖3 不同溫度處理下葉綠素b 含量的變化

圖4 不同溫度處理下類胡蘿卜素含量的變化

從圖2～圖4 可見，低溫處理后，葉綠素a 含量增加較多的5 個(gè)水稻品種（品系）分別是廩實(shí)528、秋光、吉粳95、通科27 和輝粳7，比常溫處理分別增加了109%、56%、54%、47%和 27%；吉粳 507、吉粳 515、鐵06 等3 個(gè)品種（品系）則表現(xiàn)為下降，分別下降了28%、20%和18%。而宏科67、通禾 16-8037、通35、長白9 等4 個(gè)品種（品系）低溫處理前后葉綠素a 的含量變化不明顯。參試水稻品種處理效應(yīng)值由高到低表現(xiàn)為：廩實(shí) 528＞秋光＞吉粳 95＞通科 27＞輝粳 7＞鐵 19＞秋田小町＞長白9＞吉宏9＞宏科67＞通35＞通科16-8037＞鐵 06＞吉粳 515＞吉粳 507。低溫脅迫處理效應(yīng)不顯著的有宏科67、通禾16-8037、通35。

低溫（5℃）處理后，葉綠素b 含量增加較多的5 個(gè)水稻品種（品系）分別是廩實(shí)528、吉粳95、輝粳7、秋田小町和通科27，比常溫處理分別增加了231%、78%、72%、45%和42%；表現(xiàn)為下降的水稻品種（品系）有吉粳515、鐵16 和通禾16-8037，分別下降了29%、17%和13%；低溫處理前后葉綠素b 含量變化不顯著的水稻品種（品系）有吉粳507 和吉宏9。參試水稻品種處理效應(yīng)值由高到低表現(xiàn)為：廩實(shí)528＞吉粳 95＞輝粳 7＞秋田小町＞通科 27＞秋光＞鐵 06＞通 35＞宏科 67＞長白 9＞吉宏 9＞吉粳507＞通禾 16-80 37＞鐵19＞吉粳515。對低溫處理效應(yīng)不顯著的是吉粳507 和吉宏9。

低溫（5℃）處理后，類胡蘿卜素（Cx.x）含量增加較多的5 個(gè)水稻品種（品系）分別是通科 27、吉粳 95、廩實(shí) 528、鐵 19 和吉宏 9，比常溫處理分別增加了77%、51%、40%、27%和22%；表現(xiàn)為下降的水稻品種（品系）有通35、吉粳507、鐵06 和吉粳 515，分別下降了32%、26%、25%和11%；低溫處理前后類胡蘿卜素含量變化不顯著的水稻品種（品系）有長白9 和秋田小町。參試水稻品種處理效應(yīng)值由高到低表現(xiàn)為：通科27＞吉粳95＞廩實(shí)528＞鐵 19＞吉宏 9＞通禾 16-8037＞秋光＞宏科 67＞輝粳7＞長白9＞秋田小町＞吉粳515＞鐵06＞吉粳 507＞通 35。

2.3 水稻幼苗低溫處理前后APX活性變化

低溫條件下植物積累大量包括H2O2在內(nèi)的活性氧。APX 能分解H2O2，被認(rèn)為在植物逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用。選取6 個(gè)品種（品系）為材料測定低溫前后APX 活性值的變化。如圖5 所示，經(jīng)過低溫（5℃）處理后，除廩實(shí)528 外，其他水稻品種（品系）APX 活性含量均明顯增加，處理效應(yīng)值由大到小表現(xiàn)為：秋田小町＞吉粳507＞吉玉粳＞通科27＞廩實(shí)698＞廩實(shí)528。

2.4 水稻幼苗低溫處理前后GPX活性變化

圖5 低溫處理前后APX 活性值變化情況

圖6 低溫處理前后GPX 活性值變化

GPX 是清除植物體內(nèi)活性氧的一種關(guān)鍵酶，當(dāng)植物受到低溫脅迫時(shí)體內(nèi)的活性氧水平會大大升高。選取6 個(gè)品種（品系）為材料測定低溫前后GPX 活性值的變化。如圖6 所示，經(jīng)過低溫（5℃）處理后，參試水稻品種（品系）GPX 活性含量均明顯增加，處理效應(yīng)值由大到小表現(xiàn)為：通科27＞秋田小町＞吉玉粳＞廩實(shí)698＞廩實(shí)528＞吉粳507。

2.5 低溫處理下MDA含量與葉綠體色素含量的相關(guān)性

相關(guān)性分析表明，低溫（5℃）處理下，水稻幼苗葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量的處理效應(yīng)值隨著MDA 含量的處理效應(yīng)值的增加而降低，其相關(guān)系數(shù)分別為 r=-0.117、r =-0.049 和r=-0.335，均未達(dá)到顯著水平（圖7）。表明水稻幼苗葉綠體色素在低溫逆境脅迫下并沒有發(fā)生顯著損傷，可能具有正反饋機(jī)制抵御冷害脅迫。

2.6 低溫處理下MDA含量與GPX活性的相關(guān)性

相關(guān)性分析表明，低溫（5℃）處理下，水稻幼苗APX 活性隨著MDA 含量的處理效應(yīng)值的增加而增加，但相關(guān)性不顯著（r=0.672，P=0.144）；GPX 活性的處理效應(yīng)值隨著MDA 含量的處理效應(yīng)值的增加而呈降低的趨勢，表明低溫脅迫下GPX 的活性呈增強(qiáng)的趨勢，但相關(guān)性不顯著（r=-0.113，P=0.832）（圖 8）。MDA 含量的低溫處理效應(yīng)與APX、GPX 活性的相關(guān)性未達(dá)到顯著水平，可能與處理樣本數(shù)量較少有關(guān)。

3 討論

本試驗(yàn)選取吉林省21 個(gè)中晚熟水稻品種（品系）為材料，選取MDA 含量、葉綠體色素含量、APX 活性及GPX 活性等生理生化指標(biāo)，分析水稻幼苗低溫處理前后各項(xiàng)生理生化指標(biāo)與水稻品種耐冷性之間的關(guān)系。

不同水稻品種經(jīng)低溫處理后，MDA 含量均明顯增加，而且不同品種之間存在顯著差異。MDA 含量作為測定細(xì)胞膜損傷程度大小的生理指標(biāo)和脂質(zhì)過氧化指標(biāo)，能夠充分反映細(xì)胞膜脂過氧化程度和植物對逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)弱。因此，可以通過分析不同水稻品種MDA 含量在不同溫度下的處理效應(yīng)值大小來判定水稻品種耐冷性強(qiáng)弱[7-9]。

葉綠體色素作為植物光合作用中吸收光能的光合色素，其含量的多少直接影響水稻光合作用的強(qiáng)弱，所以葉綠體色素含量的大小與水稻的抗逆性有一定的聯(lián)系[11-13]。經(jīng)低溫處理后，通過對水稻幼苗葉綠體色素含量的分析不能明確區(qū)分出耐冷性強(qiáng)的水稻品種，其原因可能是水稻幼苗葉綠體色素在低溫逆境脅迫下并沒有發(fā)生顯著損傷。因此，葉綠體色素含量是否能反映水稻耐冷性強(qiáng)弱還需進(jìn)一步研究證明。

APX 與GPX 都屬于清除活性氧過程中的重要成員[14-16]。本研究從21 個(gè)吉林省中晚熟水稻品種（品系）中選取6 個(gè)品種來探究水稻幼苗耐冷性與二者之間的關(guān)系。經(jīng)低溫處理后，水稻幼苗的APX 活性呈增加的趨勢，能使水稻幼苗在生長發(fā)育階段受到低溫脅迫而產(chǎn)生的H2O2的分解。GPX 活性呈增加的趨勢，表明低溫脅迫下活性氧種類（ROS）可不同程度地被清除。與耐冷性相關(guān)性不顯著可能與參試的品種過少有關(guān)。但仍然體現(xiàn)出APX 與GPX 對于水稻耐冷性鑒定研究發(fā)揮著重要作用[17-18]。

水稻的耐冷性研究過程是一個(gè)復(fù)雜而又龐大的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，不是通過對單個(gè)因素研究或者改變就能夠使水稻耐冷性得到提高[19]。在本研究中，水稻幼苗經(jīng)低溫處理會導(dǎo)致MDA 含量呈明顯增加的趨勢，以此來選取吉林省耐冷性強(qiáng)的水稻品種。但是葉綠體色素含量經(jīng)過低溫處理前后變化并沒有呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性，而且與MDA 含量相關(guān)性不顯著，表明葉綠體色素在低溫下并沒有發(fā)生顯著損傷。通過選取6 個(gè)品種來探究水稻幼苗耐冷性與APX 活性與GPX 活性的關(guān)系，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

圖7 MDA 含量處理效應(yīng)值與葉綠體色素含量處理效應(yīng)值的相關(guān)性

圖8 MDA 含量處理效應(yīng)值與APX、GPX 處理效應(yīng)值的相關(guān)性

4 結(jié)論

水稻幼苗經(jīng)低溫處理，MDA 含量顯著增高，表明MDA 含量能夠反映水稻耐冷性的強(qiáng)弱。試驗(yàn)結(jié)果表明，宏科 67、通禾16-8037、通科27、宏科 87 和輝粳7耐冷性較強(qiáng)，可作為吉林省耐冷育種的親本，而吉玉粳、鐵19、廩實(shí)698、吉粳507 和秋天小町在栽培過程中，應(yīng)注意對低溫冷害的防御。低溫處理下，葉綠素a、葉綠素b 與類胡蘿卜素含量呈增加趨勢，但并不顯著。而且三者含量與MDA 含量相關(guān)性不顯著，其原因可能是葉綠體色素在低溫脅迫下并沒有發(fā)生顯著損傷，表明葉綠體色素能否作為反映水稻幼苗耐冷性強(qiáng)弱還需進(jìn)一步研究證明。水稻幼苗經(jīng)低溫處理后，APX 活性與GPX 活性呈增加趨勢，但二者與MDA 含量的相關(guān)性不顯著。二者作為清除活性氧過程中的重要成員，對水稻品種（品系）耐冷性鑒定研究起著重要的作用。