劉夢(mèng)蘭 高鵬 姚澤天 馮志明，2 陳宗祥，2 張澤洲 袁林喜 康厚祥 潘學(xué)彪 左示敏 ，2*

（1 江蘇省作物遺傳生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/植物功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省作物基因組學(xué)和分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009；2 江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心/揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州225009；3 中國地質(zhì)大學(xué)（武漢）生物地質(zhì)和環(huán)境地質(zhì)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430074；4 江蘇省硒生物工程技術(shù)研究中心，江蘇蘇州 215123；5 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京100193；*通訊作者：smzuo@yzu.edu.cn）

硒是一種多功能的、人體所必需的生命元素，以硒氨基酸形式參與蛋白質(zhì)的合成，具有重要的生理活性。攝入適量硒能夠提高人體對(duì)多種重金屬的解毒作用，增加人體免疫功能，具有抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)心血管和心肌功能健康的作用[1]。研究表明，硒的生物學(xué)功能不僅取決于總硒的含量，還與硒的化學(xué)形態(tài)，即無機(jī)硒和有機(jī)硒密切相關(guān)[2]。無機(jī)硒是指四價(jià)的亞硒酸鹽和六價(jià)的硒酸鹽，有機(jī)硒主要以硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸、硒甲基硒代半胱氨酸等形式存在，有機(jī)硒是人體攝取硒元素的主要來源[3]。

人體缺硒容易患克山病、大骨節(jié)病、血管疾病、癌癥、腫瘤以及加速人體衰老等。我國營(yíng)養(yǎng)學(xué)家楊光圻在1973 年首次揭露，克山病和大骨節(jié)病是我國典型的也是最為嚴(yán)重的地方性疾病[4-7]；其團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)克山病病區(qū)居民長(zhǎng)期處于世界罕見的低硒地區(qū)[8]，該地區(qū)人體血漿、毛發(fā)硒含量極低，人體膳食硒攝入量?jī)H為11 μg，遠(yuǎn)低于非病區(qū)。然而, 硒攝入也不宜過量，如湖北恩施爆發(fā)的地方病——脫發(fā)掉甲病，其病因被發(fā)現(xiàn)與硒攝入過量（＞800 μg）有關(guān)[9]。據(jù)此，楊光圻提出了人體對(duì)硒的膳食最低需求量、適宜需求量和最大安全需求量。該研究也被FAO、WHO、IAEA 所采用并定義了硒最低需要量（以預(yù)防克山病發(fā)生為界限）為17 μg/d，生理需要量（以GPx 達(dá)到飽和為正常的生理功能指標(biāo)）為40 μg/d，膳食最高安全攝入量為400 μg/d[10]。在此范圍內(nèi)，適當(dāng)增加硒攝入量有利于提高人體免疫力和抗衰老能力。近年來，我國衛(wèi)生部也采用此標(biāo)準(zhǔn)專門頒發(fā)了富硒食品的硒含量標(biāo)準(zhǔn)[11]。

根據(jù)地質(zhì)學(xué)家考證，我國從東北、華北到西北存在一條低硒帶，涉及22 個(gè)省市，除去山區(qū)，相當(dāng)于全國有近72%的地區(qū)屬于缺硒地區(qū)[12-13]。由于人體不能自主合成硒，硒元素供給必須通過食補(bǔ)，而糧食等天然食物硒含量較低，因此，改善人體硒攝入水平的根本途徑是合理提高農(nóng)產(chǎn)品硒含量[14]。水稻是我國最主要的糧食作物，有一半以上人口以稻米為主食，而正常情況下，稻米的硒含量為32 μg/kg，遠(yuǎn)不能滿足人體對(duì)硒的需求[15]。因此，開發(fā)富硒稻米具有重要現(xiàn)實(shí)意義。本研究通過采用根部施用或葉面噴施，將不同濃度的硒肥施用于不同的優(yōu)良食味粳稻品種中，研究不同施硒方式和濃度對(duì)不同品種稻米硒積累的影響，以篩選有效的施肥措施和富硒能力強(qiáng)的優(yōu)良食味水稻品種，為優(yōu)質(zhì)高效的富硒大米開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品種及肥料

供試品種為揚(yáng)農(nóng)稻1 號(hào)、南粳9108、南粳5055、南粳46、揚(yáng)粳805 和紫稻。其中，南粳46、南粳9108 和南粳5055 為江蘇近年主推的優(yōu)良食味軟米品種，曾在國內(nèi)多次優(yōu)良食味水稻評(píng)比中榮獲一等獎(jiǎng)；紫稻為本實(shí)驗(yàn)室自行選育的粳稻品系，葉片淡紫色，糙米為黑色。

供試硒肥由蘇州硒谷科技有限公司提供，其中葉面噴施的液體肥（產(chǎn)品代碼SETEK-BF-003）總硒含量為5 000 mg/L，根部撒施的顆粒肥（產(chǎn)品代碼SETEKBF-001）總硒含量為 1 000 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2018 年3 月份進(jìn)行試驗(yàn), 試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在江蘇省鎮(zhèn)江市京口區(qū)新民洲臨港產(chǎn)業(yè)園（原國營(yíng)共青團(tuán)農(nóng)場(chǎng)）內(nèi)，試驗(yàn)地土壤質(zhì)地為半黏土。試驗(yàn)前進(jìn)行土壤基礎(chǔ)硒含量測(cè)定。

試驗(yàn)設(shè)根部撒施和葉面噴施兩種施肥處理，每個(gè)處理3 個(gè)硒肥水平，試驗(yàn)小區(qū)30 m2，3 次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。根部撒施的低、中、高3 個(gè)施肥水平分別為：7.5 kg/667 m2、15.0 kg/667 m2和 22.5 kg/667 m2，在水稻破口期進(jìn)行，設(shè)空白處理作對(duì)照（CK）。葉面噴施的低、中、高 3 個(gè)施肥水平分別為：50 mL/667 m2、100 mL/667 m2和150 mL/667 m2，在水稻揚(yáng)花期進(jìn)行，噴施等量清水作對(duì)照（CK）。

水稻成熟期，采用3 點(diǎn)取樣法，每個(gè)品種、每個(gè)處理各取90 株，收獲全部稻穗，脫粒后裝網(wǎng)袋內(nèi)正常晾曬。

1.3 硒含量、形態(tài)測(cè)量方法

1.3.1 土壤硒含量

在試驗(yàn)田采用5 點(diǎn)取樣法，取0～20 cm 耕層土壤作樣本，共采集5 個(gè)樣本。在鄰近田塊同樣方法取得5個(gè)樣品，混合成1 個(gè)樣品作為對(duì)照。土壤樣品采集完成后風(fēng)干，當(dāng)達(dá)到半干狀態(tài)時(shí)將土塊壓碎，除去其中的礫石、碎石、生物殘骸和植物根系等雜物。然后進(jìn)一步烘干，干燥后將其粉碎，過200 目篩，采用四分法稱取100 g 左右的土壤裝袋，待測(cè)。

稱取約0.5 g 土壤，過200 目篩，將樣品置于100 mL 的三角瓶中，加入10 mL 的優(yōu)級(jí)濃硝酸和高氯酸混合酸（HNO3∶HClO4=4∶1），靜置過夜后，在 350℃電熱板上消化3 h，消化至無色并冒白煙，取下稍冷后加入5 mL 濃HCl，繼續(xù)加熱至無色并冒白煙，取下冷卻至室溫，再加5 mL HCl，全部轉(zhuǎn)入50 mL 容量瓶中，用超純水定容，制成待測(cè)液。用原子熒光光譜儀測(cè)定待測(cè)液中的硒含量。

1.3.2 籽粒硒含量

測(cè)定各處理糙米硒含量以及南粳46 葉面噴施高水平硒肥處理的精米硒含量。將烘干的樣品粉碎，過200 目篩，將過篩后的樣品置于4℃冰箱中避光保存。檢測(cè)在江蘇省硒生物工程技術(shù)研究中心進(jìn)行。微波萃取測(cè)定硒含量，具體方法：稱取0.5 g 干燥籽粒粉末，加入到準(zhǔn)備好的玻璃試管當(dāng)中，再加入5 mL 濃硝酸、3 mL 的水和2 滴過氧化氫。采用如下萃取程序：800 W，10 min 升溫到150℃，控制溫度于150℃進(jìn)行消解10 min。消解結(jié)束后，冷卻，打開消解罐，消解液過濾，并定容至50 mL 容量瓶中，混勻后量取10 mL 溶液加入離心管中，直接用ICP-MS 測(cè)定硒總量。

1.3.3 籽粒硒形態(tài)

測(cè)定高硒肥水平處理后幾個(gè)水稻品種精米硒含量。樣品制備同1.3.2。稱取0.5 g 樣品于消解罐中，加入15 mg 蛋白酶 XIV 和10 mL 超純水進(jìn)行微波萃取。采用如下萃取程序：200 W，10 min 升溫到37℃，控溫37℃萃取30 min。通過高效液相色譜（HPLC；LC20AT；Shimadzu，Kyoto，Japan）分離提取物，萃取液經(jīng)離心（6000 r/min，5 min）后，過 0.45 μm 水性濾膜，進(jìn)行硒形態(tài)分析。同樣方法做空白試驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003 和SPSS 11.5 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤基礎(chǔ)硒含量分析

檢測(cè)結(jié)果表明，試驗(yàn)田硒含量平均值為69.1 μg/kg，最高值為 69.5 μg/kg，最低值為 68.7 μg/kg。與全國土壤背景值0.29 mg/kg 相比[16]，本試驗(yàn)田土壤硒含量極低，這也表明江蘇處于低硒帶地區(qū)，與前人的認(rèn)識(shí)一致[12]。

2.2 不同施硒方式下不同水稻品種籽粒硒含量比較

采用3 因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)籽粒硒含量進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表1。從表1 可見，不同品種間籽粒硒含量差異達(dá)到極顯著水平，施肥方式和品種間以及硒肥濃度和品種間的互作也都達(dá)到顯著水平。說明水稻品種對(duì)施用硒肥的敏感性有差異，篩選合適的品種，并采用適宜的施硒方式，可以經(jīng)濟(jì)有效的提高水稻籽粒硒含量。

表1 3 因素試驗(yàn)水稻籽粒硒含量方差分析

圖1 根部撒施不同硒肥水平對(duì)水稻品種糙米硒含量的影響

圖2 葉面噴施不同硒肥水平對(duì)水稻品種糙米硒含量的影響

2.2.1 根施處理不同水稻品種糙米硒含量比較

從圖1 可見，未施硒肥處理，不同品種間糙米硒含量存在顯著差異，南粳46 糙米含硒量最低，僅5.73 μg/kg，揚(yáng)農(nóng)稻 1 號(hào)最高，達(dá)到 34.05 μg/kg；根部撒施硒肥，不同品種糙米硒含量都顯著增加，隨著硒肥施用量的增加，大部分品種糙米硒含量的增加也達(dá)到顯著水平，僅有個(gè)別品種表現(xiàn)略有不同。如南粳5055 在低、中硒肥水平間糙米硒含量差異不顯著，而南粳46 在中、高硒肥水平間糙米硒含量差異不顯著。在低硒水平下，揚(yáng)農(nóng)稻1 號(hào)糙米硒含量為38.86 μg/kg，低于富硒稻谷硒含量標(biāo)準(zhǔn)，其他品種糙米硒含量都高于40 μg/kg，在富硒稻谷標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的范圍內(nèi)（40～300 μg/kg）。在高硒肥水平下，以揚(yáng)粳805 糙米硒含量最高，達(dá)到316.45 μg/kg，其次為南粳9108、南粳5055、紫稻及揚(yáng)農(nóng)稻1 號(hào)，南粳46 糙米硒含量最低，僅為114.8 μg/kg，不到揚(yáng)粳805的一半。

2.2.2 葉面噴施處理不同水稻品種糙米硒含量比較

從圖2 可見，清水處理各品種糙米硒含量與未進(jìn)行根部撒施硒肥的空白對(duì)照一致。葉面噴施硒肥，不同品種糙米硒含量都顯著增加。隨著硒肥量的增加，不同品種糙米硒含量有增加的趨勢(shì)，部分品種糙米硒含量在兩個(gè)硒肥水平處理間差異達(dá)顯著水平，如高硒肥水平與低硒肥水平間比較，除揚(yáng)農(nóng)稻1 號(hào)以外的5 個(gè)品種糙米硒含量都顯著增加，中硒肥水平與低硒肥水平比較，僅有南粳5055 和紫稻兩個(gè)品種糙米硒含量增加達(dá)顯著水平。在低硒肥水平下，僅南粳5055 糙米硒含量為36.86 μg/kg，低于富硒稻谷標(biāo)準(zhǔn)，其他品種糙米硒含量都高于40 μg/kg，在富硒稻谷標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的范圍內(nèi)（40～300 μg /kg）。在高硒肥水平下，以南粳 5055 糙米硒含量最高，達(dá)286.82 μg/kg，其次為南粳9108、揚(yáng)粳805 以及紫稻，再次是揚(yáng)農(nóng)稻1 號(hào)和南粳46，分別為121.59 μg/kg 和 127.10 μg/kg。硒含量最高的品種是最低品種的2 倍以上，說明不同品種富集硒的能力存在顯著差異。揚(yáng)農(nóng)稻1 號(hào)糙米硒含量在3 個(gè)硒肥水平處理間差異都不顯著，南粳46 高硒肥水平下糙米硒含量盡管顯著高于中、低硒肥水平，但增加幅度較小，而紫稻高硒肥水平下糙米硒含量還略低于中硒肥水平，說明這3 個(gè)品種對(duì)高硒肥水平敏感性較差。

2.3 水稻精米和糙米硒含量比較

從圖3 可見，葉面噴施硒肥的處理精米和糙米內(nèi)的硒含量沒有顯著差異，說明稻米硒主要儲(chǔ)存在精米中，富硒稻谷加工成精米后基本不影響人們對(duì)硒元素的食用需求，這與開建榮的研究結(jié)果一致[17]。

2.4 水稻籽粒硒形態(tài)及含量比較

圖3 葉面噴施硒肥后南粳46 精米和糙米中硒含量比較

圖4 水稻籽粒硒形態(tài)比較

人體內(nèi)硒生物活性不僅取決于攝入的總硒量，還與硒的化學(xué)形態(tài)密切相關(guān)[18]。由圖4 可以看出，水稻精米中檢測(cè)不到無機(jī)硒，只含有3 種形態(tài)的有機(jī)硒，即硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸?？傮w上，不論是根施還是葉片噴施，硒代蛋氨酸含量均最高，占稻米總硒含量80%左右，硒代半胱氨酸所占比例較少，僅占10%左右，硒甲基硒代半胱氨酸所占比例最少。本研究結(jié)果表明，富硒精米中的硒形態(tài)是利于人體吸收的安全有機(jī)硒。

國內(nèi)外大量研究證實(shí)，硒甲基硒代半胱氨酸與其他兩種形態(tài)的硒相比是最有效的抗癌含硒化合物[19-22]。由圖4 根部撒施與葉面噴施比較可知，硒甲基硒代半胱氨酸含量跟品種和施肥方式有很大關(guān)系。檢測(cè)結(jié)果表明，紫稻在根施或是葉面噴施中都含有硒甲基硒代半胱氨酸，而南粳46，南粳9108 只有在葉面噴施條件下才會(huì)合成硒甲基硒代半胱氨酸，南粳5055 在根施和葉面噴肥方式下均不含有硒甲基硒代半胱氨酸。表明葉面噴硒有利于水稻品種合成硒甲基硒代半胱氨酸。

3 討論與結(jié)論

臨床醫(yī)學(xué)研究表明，硒元素對(duì)人體健康以及抑制腫瘤和癌癥發(fā)生具有重要作用[23-25]。因此，通過對(duì)水稻施用硒肥來提高稻米的含硒量，可為低硒地區(qū)人體提供富硒稻米，滿足人體對(duì)硒元素的需求。

本研究通過根部撒施和葉面噴施兩種硒肥施用方式，采用低、中、高三種施肥水平，對(duì)南粳9108、南粳5055、南粳 46、揚(yáng)粳 805、揚(yáng)農(nóng)稻 1 號(hào)、紫稻等 6 個(gè)優(yōu)質(zhì)粳稻品種的稻米硒含量進(jìn)行測(cè)定分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在兩種施肥方式中，中、高硒肥水平處理后稻米硒含量都達(dá)到富硒稻米標(biāo)準(zhǔn)，揚(yáng)粳805 在根部撒施條件下富集硒能力最強(qiáng)，南粳5055 在葉面噴施條件下富集硒能力最強(qiáng)。因此，生產(chǎn)上可以選擇南粳5055 和揚(yáng)粳805 開發(fā)富硒大米。另外，還發(fā)現(xiàn)揚(yáng)農(nóng)稻1 號(hào)和南粳46 對(duì)硒葉面噴施濃度的敏感性差，南粳5055、南粳9108 和揚(yáng)粳805 這3 個(gè)品種對(duì)硒肥葉面噴施濃度的敏感性高。因此，對(duì)敏感性差的品種，可以通過噴施少量硒肥來提高稻米的硒含量；對(duì)敏感性高的品種，可以通過噴施適量多的硒肥來大幅提高稻米的硒含量[26-30]。這些結(jié)果為富硒優(yōu)質(zhì)稻米開發(fā)中的品種選擇和硒肥施用技術(shù)選擇提供了理論參考，具有重要的實(shí)際意義。

人們食用稻米主要以精米為主，本研究檢測(cè)了葉面噴施高水平硒肥南粳46 的精米和糙米硒含量，發(fā)現(xiàn)兩者沒有顯著差異，這一結(jié)果與開建榮的結(jié)果一致[17]，說明施用硒肥生產(chǎn)的富硒稻米，加工成精米后能夠滿足人們補(bǔ)充硒元素的食用要求。也有研究表明，硒主要累積在糙米當(dāng)中，可能是由于品種、施肥方式以及肥料種類不同所引起的[31]。

本研究對(duì)稻米中硒形態(tài)檢測(cè)表明，硒肥處理后水稻籽粒中檢測(cè)不到不利于人體吸收的無機(jī)硒，相反主要存在對(duì)人體安全且易吸收的有機(jī)硒，包括硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸和硒甲基硒代半胱氨酸。通過對(duì)比葉面噴施和根部撒施結(jié)果，發(fā)現(xiàn)葉面噴施更利于硒甲基硒代半胱氨酸的積累。而據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，硒甲基硒代半胱氨酸與其他有機(jī)硒相比是最有效的抗癌含硒化合物[23-25]。另據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，添加在土壤中的硒不能被植物有效吸收，殘留的硒會(huì)被土壤微生物浸出或者保留在土壤中，對(duì)土壤環(huán)境造成污染[32]。綜合這幾個(gè)方面，筆者認(rèn)為與根部撒施相比，葉面噴施不僅能產(chǎn)生較高的經(jīng)濟(jì)效益，而且用量少，更加環(huán)保，是目前生產(chǎn)富硒大米的較好方式。