王穎， 張富春

(1. 新疆大學(xué)紡織與服裝學(xué)院，烏魯木齊830046； 2. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊830046)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，犬Canislupusfamiliaris作為寵物伴侶進(jìn)入了千家萬戶，寵物犬?dāng)?shù)量不斷增多的同時，越來越多的流浪犬出現(xiàn)在城市的大街小巷中。龐大數(shù)量的流浪犬不僅嚴(yán)重影響人們的日常生活、城市的環(huán)境衛(wèi)生，還增加了人們罹患各種疾病的危險(王金霞，2016)。因?yàn)榱骼巳粌H是狂犬病的宿主，還是諸多寄生蟲的中間或終末宿主(李斌等，2016；汪天平，操治國，2018)。目前控制流浪犬?dāng)?shù)量主要是通過棒殺、毒殺、絕育等方法，這些方法都存在一些局限性，無法廣泛并有效應(yīng)用于控制流浪犬?dāng)?shù)量(莊心依等，2017)。避孕疫苗是利用在生殖過程中具有重要作用的蛋白或激素作為靶標(biāo)抗原，免疫動物后控制其生育的一種方法，相比傳統(tǒng)控制流浪犬?dāng)?shù)量的方法，其具有低成本、環(huán)保、符合動物福利等優(yōu)點(diǎn)(樊姝彤等，2017)。但是目前還沒有能高效控制流浪犬生育數(shù)量的避孕疫苗商品，因此開發(fā)一款能有效控制流浪犬?dāng)?shù)量的避孕疫苗具有良好的市場前景。

卵透明帶(zona pellucida，ZP)是一種特殊的細(xì)胞外透明基質(zhì)，圍繞在排出的卵子和早期胚胎周圍(Nixonetal.，2007)，其形成對卵巢卵泡的發(fā)育、受精、囊胚形成、早期胚胎的運(yùn)輸必不可少(Talbotetal.，2003；Nixonetal.，2007)。ZP基質(zhì)主要由ZP1、ZP2、ZP3糖蛋白構(gòu)成(Spargo & Hope，2003)，其中，ZP3作為精子的初級受體，在精子與卵子結(jié)合和激發(fā)精子頂體反應(yīng)中發(fā)揮重要作用(Bagavantetal.，1997；Srivastaveetal.，2002)。研究表明，用ZP3作為靶抗原的蛋白疫苗免疫犬(Srivastaveetal.，2002)、兔Oryctolaguscuniculus(Mackenzieetal.，2006)、灰袋鼠Macropusgiganteus(Kitcheneretal.，2009a)、樹袋熊Phascolarctoscinereus(Kitcheneretal.，2009b)和小鼠Musmusculus(Guptaetal.，2013；Shresthaetal.，2014，2015)等都取得了良好的避孕效果。但是純化ZP3重組蛋白的生產(chǎn)成本高、工藝繁瑣，且蛋白不易保存，因此很難在臨床實(shí)踐中廣泛應(yīng)用。DNA疫苗是一種將編碼靶標(biāo)抗原的重組真核表達(dá)載體通過肌肉、皮下或黏膜途徑給人或動物免疫后，使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)機(jī)體特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答的方法。與傳統(tǒng)的蛋白疫苗相比，DNA疫苗更穩(wěn)定(Sasakietal.，2003；Sunetal.，2010)、更經(jīng)濟(jì)(Sasakietal.，2003)、維持免疫原性時間長，且易于生產(chǎn)(Alarconetal.，1999；Robinson & Pertmer，2000)。本研究以犬卵透明帶3(CZP3)為靶蛋白制備了CZP3 DNA疫苗，在小鼠模型上注射后輔以電脈沖刺激以增強(qiáng)DNA疫苗的免疫效果，對其避孕效果進(jìn)行了初步的評價，為CZP3 DNA 避孕疫苗在流浪犬上的推廣應(yīng)用建立了基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及材料

pcDNA3、pcDNA3-CZP3由本實(shí)驗(yàn)室保存及構(gòu)建。6～8周齡12只BALB/c小鼠，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0011，購自北京維通利華，比格犬卵巢由新疆醫(yī)學(xué)院科技樓惠贈。CZP3c重組蛋白為本實(shí)驗(yàn)室純化并保存。HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗、FICT標(biāo)記的兔抗鼠二抗、BSA購自生工生物工程(上海)股份有限公司，孕馬血清(PMSG)、人絨毛促性腺激素(hCG)購自寧波第二激素廠，透明質(zhì)酸酶購自Sigma。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 質(zhì)粒的提取、純化及定量

按《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》(張富春等，2008)中的實(shí)驗(yàn)步驟，對pcDNA3、pcDNA3-CZP3進(jìn)行質(zhì)粒的提取及純化。用紫外分光光度儀定量滅菌生理鹽水溶解純化后的質(zhì)粒，使其終濃度為1 μg·μL-1。

1.3 小鼠免疫

12只BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為2組(n=6)：實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組，第0、2、4周分別向每只小鼠腿部肌肉注射50 μL pcDNA3-CZP3和pcDNA3質(zhì)粒，然后迅速進(jìn)行6次電脈沖(電壓30 V)刺激。初免后，每周從小鼠眼眶靜脈叢取血，分離血清，-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ELISA檢測抗體水平

用純化后的CZP3c重組蛋白作為包被抗原，濃度為10 μg·mL-1。血清的稀釋倍數(shù)為1∶100，山羊抗小鼠二抗的稀釋倍數(shù)為1∶2 000，OD450檢測抗體水平。

1.5 抗體滴度檢測

選擇抗體水平最高的第6周血清進(jìn)行倍比稀釋，血清按照1∶50、1∶500、1∶1 000、1∶1 200、1∶4 000進(jìn)行稀釋，ELISA檢測各組的抗體滴度。

1.6 小鼠卵子的間接免疫熒光

取5只BALB/c雌性小鼠進(jìn)行超數(shù)排卵實(shí)驗(yàn)。每只小鼠肌肉注射12 IU的PMSG，46 h后肌肉注射12 IU的hCG。13 h后處死小鼠，收集壺腹部卵子。用5 IU的透明質(zhì)酸酶室溫消化5 min后，將卵子轉(zhuǎn)移至BMOC培養(yǎng)基制作的液滴中。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗卵子數(shù)次后，計數(shù)，將卵細(xì)胞平均分為2組放置于防脫載玻片上。無水乙醇固定后，5%BSA，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中封閉1 h。PBS沖洗3次后，加入一抗(稀釋倍數(shù)為1∶50)，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。PBS沖洗3次后，加入FITC標(biāo)記的兔抗鼠二抗(1∶200)，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min。PBS充分清洗，甘油封片后于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.7 犬卵巢切片的間接免疫熒光

比格犬卵巢固定后委托新疆醫(yī)學(xué)院科技樓病理切片室制作成5 μm厚切片。56 ℃烤片1 h后，乙醇脫蠟，檸檬酸鹽微波加熱修復(fù)抗原10 min。切片溫度降至室溫后，用PBST清洗。用含有2%兔血清的PBS 37 ℃孵育封閉1 h。一抗(1∶50)4 ℃孵育過夜。PBST清洗切片后，加入FITC標(biāo)記的兔抗鼠二抗(1∶200)，37 ℃孵育30 min。充分清洗后用甘油封片于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.8 避孕效果檢測

初免后第6周，對每組小鼠進(jìn)行分籠，每籠3只小鼠。同時每籠放入1只具有生殖能力的雄鼠進(jìn)行合籠實(shí)驗(yàn)。雄鼠每天輪換1次，3周后取出，計算雌鼠的產(chǎn)仔數(shù)及生育率。

1.9 組織學(xué)分析

第24周處死小鼠，取出卵巢用4%多聚甲醛固定24 h。卵巢經(jīng)脫水、包埋后，制成2張5 μm厚的連續(xù)切片。切片經(jīng)HE染色后于顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠抗CZP3抗體水平檢測

初免后第2周，實(shí)驗(yàn)組小鼠即產(chǎn)生了抗CZP3的抗體，抗體水平與陰性對照組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。初免后第3周，實(shí)驗(yàn)組的抗體水平迅速上升，到初免后第6周達(dá)到峰值，隨后開始下降，直到初免后第24周，一直維持在一定水平。t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，從初免后第3周到第24周，實(shí)驗(yàn)組的抗體水平與陰性對照組之間的差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。

圖1 犬卵透明帶3抗體水平檢測Fig. 1 Detection of antibody levels against canine zona pellucida 3

與陰性對照組相比Compared with the negative control group，*P<0.05，***P<0.001； 下同the same below

2.2 抗體滴度檢測

t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)血清稀釋至1∶4 000倍時，實(shí)驗(yàn)組的抗體滴度與陰性對照組之間的差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖2)。

圖2 ELISA檢測血清中的抗體效價Fig. 2 Antibody titer of serum detected by ELISA

2.3 間接免疫熒光

間接免疫熒光結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠產(chǎn)生的血清抗體不僅可以識別小鼠卵子的透明帶基質(zhì)(圖3：A)，也可與犬卵巢切片中的卵子外透明帶基質(zhì)結(jié)合(圖3：B)，并且與犬的其他組織無交叉反應(yīng)。

圖3 小鼠卵子(A)與犬卵巢切片(B)的間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)Fig. 3 Indirect immunofluorescence assay of mouse oocytes and dog ovarian sections

a， c. pcDNA3， b， d. pcDNA-CZP3； 上upper. 明場bright filed， 下lower. 熒光場fluorescence field

2.4 抗生育效果實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，生育率由陰性對照組的100%下降至實(shí)驗(yàn)組的50%；產(chǎn)仔數(shù)由陰性對照組的40只降低到實(shí)驗(yàn)組的15只。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組(2.500只±1.455只)與陰性對照組(6.667只±0.422只)的產(chǎn)仔數(shù)之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Spearman相關(guān)性分析顯示，實(shí)驗(yàn)組抗體水平與產(chǎn)仔數(shù)呈高度負(fù)相關(guān)(r=-0.941 1)(圖4)。

圖4 抗體水平與小鼠產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)性分析Fig. 4 Correlation between antibody levels and litter size of mouse

2.5 小鼠卵巢組織學(xué)分析

卵巢切片顯示，與陰性對照組相比，實(shí)驗(yàn)組懷孕小鼠卵巢的卵泡發(fā)育正常，初級卵泡、次級卵泡以及成熟卵泡數(shù)量均正常；且實(shí)驗(yàn)組小鼠在不孕情況下的卵泡也發(fā)育正常(圖5)。

3 討論

與傳統(tǒng)疫苗相比，DNA疫苗具有眾多優(yōu)點(diǎn)，如DNA疫苗能夠在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生“內(nèi)源性”抗原，從而激發(fā)CD4+和CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答，但自Wolff發(fā)明DNA疫苗以來，近30年獲得批準(zhǔn)上市的DNA疫苗卻很少(Kutzler & Weiner，2008)。制約DNA疫苗走向臨床應(yīng)用的瓶頸就是相對傳統(tǒng)疫苗，DNA疫苗的免疫原性較差(Kimetal.，2010)。研究人員為此進(jìn)行了一系列研究，如使用強(qiáng)有力的啟動子(Lukeetal.，2011)、免疫時使用傳統(tǒng)佐劑或分子佐劑(Maetal.，2014；Pengetal.，2014；Almeidaetal.，2015；Bergamaschietal.，2015)、使用靶向DNA疫苗技術(shù)(Fossumetal.，2015；Saigaetal.，2015；Yeetal.，2015)、采用先DNA疫苗免疫再蛋白加強(qiáng)免疫或先蛋白免疫再DNA疫苗加強(qiáng)免疫的免疫策略(Cervantes-Villagranaetal.，2013；Chuangetal.，2013；Fournillieretal.，2013)，或使用基因槍或電脈沖注射質(zhì)粒DNA(Broderick & Humeau，2015；Leeetal.，2015)，以增強(qiáng)機(jī)體對DNA疫苗的免疫應(yīng)答。電脈沖注射就是利用電流刺激注射部位的肌肉組織，使DNA質(zhì)粒能夠瞬時透過細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，從而提高質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。此外電脈沖還可以促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，招募抗原遞呈細(xì)胞及T細(xì)胞向免疫部位遷移(Leeetal.，2015)。研究顯示，利用電脈沖免疫DNA疫苗在羊Ovisaries(Scheerlincketal.，2004)、牛Bostaurus(Fowleretal.，2012)、犬(Shahbazietal.，2015)、豬Susscrofa(Shengetal.，2016)等動物實(shí)驗(yàn)中都誘導(dǎo)產(chǎn)生了較強(qiáng)的免疫應(yīng)答。為了增強(qiáng)CZP3 DNA疫苗的避孕效果，本研究采用電脈沖方式對小鼠進(jìn)行DNA疫苗免疫，電脈沖增強(qiáng)了機(jī)體對于DNA疫苗的免疫應(yīng)答，從初免后第2周起，實(shí)驗(yàn)組的抗體水平與陰性對照組之間的差異就有統(tǒng)計學(xué)意義，并且這種差異持續(xù)期近半年。此外，第6周實(shí)驗(yàn)組的抗體滴度為1∶4 000時，與陰性對照組之間的差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖5 陰性對照組(左)和實(shí)驗(yàn)組(中， 右)小鼠卵巢的組織胚胎學(xué)分析Fig. 5 Histological analysis of the negative control group (left) and the experiment group (middle and right) mice ovary

左、中. 懷孕小鼠， 右. 不孕小鼠

Left， middle. pregnant mouse， right. infertile mouse

研究表明，以ZP3為靶抗原的避孕疫苗主要是通過2種機(jī)制介導(dǎo)不孕：一種機(jī)制認(rèn)為動物免疫ZP3后產(chǎn)生充足的抗體結(jié)合于卵子外周的ZP上，阻斷了精子與卵子的結(jié)合誘導(dǎo)不孕，因此ZP3的抗體水平對于誘導(dǎo)不孕至關(guān)重要，當(dāng)ZP3的抗體水平達(dá)到某一臨界值時即誘導(dǎo)不孕(Jacksonetal.，1998；Hardyetal.，2002；Lloydetal.，2003)；另一種則認(rèn)為ZP3在ZP的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，抗ZP3的抗體與ZP3結(jié)合后會破壞ZP3的功能，導(dǎo)致形成ZP的厚度減小。此外，抗ZP3的抗體干擾顆粒細(xì)胞緊密附著于卵子，減少了顆粒細(xì)胞與卵子的聯(lián)系，導(dǎo)致卵泡的異常發(fā)育，成熟卵泡的減少，誘發(fā)卵巢功能早衰。這些卵巢組織結(jié)構(gòu)上的改變協(xié)同作用導(dǎo)致了免疫動物的不孕(Maetal.，2012a， 2012b；Tuetal.，2013；Guptaetal.，2015)。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，CZP3抗體可以結(jié)合于小鼠的ZP基質(zhì)上，從而阻斷精子與ZP的結(jié)合。此外，CZP3的抗體水平與產(chǎn)仔數(shù)呈負(fù)相關(guān)，即抗體水平越高，小鼠的產(chǎn)仔數(shù)越少，說明當(dāng)抗CZP3的抗體水平達(dá)到某一特定值后可導(dǎo)致小鼠不孕。小鼠的卵巢組織學(xué)分析顯示，免疫CZP3后抗CZP3的抗體并沒有對不孕及懷孕小鼠的卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu)及發(fā)育產(chǎn)生影響，這進(jìn)一步說明，導(dǎo)致小鼠不孕是抗CZP3的抗體所致。在間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，抗CZP3的抗體不僅可以結(jié)合于犬的ZP上，還可以結(jié)合于小鼠的ZP上，這可能與CZP3與小鼠的ZP3氨基酸序列具有66.8%的相似性(王穎等，2016)相關(guān)。

本研究輔以電脈沖的方式對小鼠注射CZP3 DNA疫苗，增強(qiáng)了小鼠免疫應(yīng)答的水平，同時顯著降低了小鼠的產(chǎn)仔數(shù)，并且CZP3 DNA疫苗的接種免疫沒有導(dǎo)致小鼠的卵巢發(fā)生病理學(xué)變化，使用安全且具有一定的免疫避孕效果，這為今后開發(fā)安全有效的CZP3 DNA避孕疫苗奠定了一定的基礎(chǔ)。