張藍天，楚單單，方云霞，吳玉環(huán)，陳建明，薛大偉，張曉勤

(1. 杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，浙江 杭州 311121； 2. 浙江省嚴州中學新安江校區(qū)，浙江 杭州 311607)

作物種質(zhì)資源是經(jīng)過長期的自然進化和人工選擇后形成的，積累了極其豐富的遺傳變異，是作物育種的物質(zhì)基礎(chǔ).作物品種的遺傳改良進程，很大一部分取決于不同類型優(yōu)質(zhì)品種資源的利用.對作物種質(zhì)資源進行正確合理的鑒定和評價是進行有效改良的基礎(chǔ).大麥(HordeumvulgareL.)是世界上古老的栽培作物之一，對環(huán)境適應(yīng)性很強[1]，廣泛分布于世界范圍內(nèi)，栽培面積在谷類作物中僅次于小麥、水稻及玉米，位居全球第四[2]，可作為糧食、飼料，也可用于啤酒釀造、保健品研發(fā)等[3].

不同國家和地區(qū)種植的大麥存在很大的差異.目前，大麥品種資源由于長期的馴化栽培、自然進化和遺傳定向改良，導致其遺傳基礎(chǔ)比較單一，遺傳背景日趨一致，在品質(zhì)和抗逆性等方面一直沒有大的突破.因而，研究不同地區(qū)大麥種質(zhì)資源的遺傳多樣性，是保護及開發(fā)利用優(yōu)質(zhì)大麥新種質(zhì)的基礎(chǔ)[4].關(guān)于大麥遺傳多樣性的研究已有較多的報道[5-11]，但大多局限于某一國家或地區(qū)，對世界大麥種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的報道較少.

分子標記由于具有不受季節(jié)與環(huán)境的影響、無表型效應(yīng)、重現(xiàn)性好、簡單快捷等優(yōu)點，已經(jīng)越來越多地被用于植物遺傳多樣性研究，常用的分子標記技術(shù)有RFLP、AFLP、RAPD、ISSR、SSR、SRAP等.SRAP (sequence-related amplified polymorphism)——相關(guān)序列擴增多態(tài)性標記技術(shù)，是2001年由Li等[12]在PCR基礎(chǔ)上發(fā)明的一項DNA分子標記技術(shù).由于該標記簡便、快速、不需預(yù)知物種的序列信息，目前已應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、基因連鎖標記、基因定位、比較基因組學研究及雜種優(yōu)勢預(yù)測等方面的相關(guān)研究[13].其中尤以遺傳多樣性的檢測應(yīng)用最為突出，在西瓜、辣椒、油菜和馬鈴薯等多種植物上成功地進行了遺傳多樣性分析[9,14-15].

本實驗以來源于不同國家和地區(qū)的115份大麥微核心種質(zhì)資源為材料，采用SRAP分子標記技術(shù)分析其遺傳多樣性，以期為大麥的遺傳基礎(chǔ)研究和育種應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 大麥種質(zhì)

大麥微核心種質(zhì)資源由浙江省農(nóng)業(yè)科學院提供，115份大麥種質(zhì)共來源于4個大洲的33個國家和地區(qū)，其中亞洲44份，北美洲5份，歐洲49份，非洲17份.

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取

大麥種子萌發(fā)在26 ℃暗室中進行，空氣相對濕度約為70%.待大麥幼苗長至兩葉期，取3 cm左右幼嫩葉片用于基因組DNA提取，參照Xue等[16]提供的方法并進行少許改動.

1.2.2 SRAP分析

根據(jù)多態(tài)性高的原則，從Li等[12]公布的引物序列中選取17對SRAP引物(表1)，并交由上海英維捷基生物技術(shù)有限公司合成.SRAP反應(yīng)體系參照Xue等[16]提供的方法并進行少許改動.

表1 17對SRAP引物序列Tab.1 17 primer sequences of SRAP-PCR

1.3 數(shù)據(jù)分析

對凝膠成像系統(tǒng)收集到的圖片進行分析，并通過人工分析統(tǒng)計得出各個引物對115份大麥種質(zhì)資源品種擴增的SRAP標記條帶.譜帶按照0/1矩陣記錄，在相同遷移位置上有SRAP譜帶記為“1”，無譜帶記為“0”，建立矩陣后進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計.利用GenAlEX 6.5軟件[17]、Arlequin 3.5軟件[18]和STRUCTURE (http://pritch.bsd.uchicago.edu/structure.html)對所獲得的數(shù)據(jù)進行相關(guān)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 SRAP引物的篩選及擴增

為了獲得穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好的SRAP引物，本實驗前期共計篩選標記72個，從中挑選出17對擴增條帶清晰、重復(fù)性好的SRAP引物組合用于進一步的實驗(圖1).利用這17對引物對不同地域來源的大麥種質(zhì)進行分析.結(jié)果表明，所有引物在不同品種中均能擴增出3條以上的不同條帶，共計獲得114個擴增條帶，其中組合em4-me8、em7-me8和em1-me9獲得擴增條帶最多，為10條.可見，本研究選用的引物檢測效率較高，在各材料間具有較好的多態(tài)性.

圖1 引物em6-me8和em4-me8對部分大麥材料DNA的SRAP擴增結(jié)果Fig.1 Profiles produced in some barley varieties by the SRAP primer em6-me8 and em4-me8

2.2 SRAP引物多態(tài)性分析

利用GenAlEX 6.5軟件對不同來源的115份大麥微核心種質(zhì)的SRAP擴增結(jié)果進行了分析，其有效等位基因數(shù)(Ne)、等位基因雜合性(He)、期望雜合度(uHe)和Shannon’s信息指數(shù)(I)分析結(jié)果見表2.結(jié)果表明，em4-me2和em8-me6引物組合中所擴增出的3個條帶在所有種質(zhì)中均未表現(xiàn)出差異，占全部位點的4.39%.在114條擴增條帶中，出現(xiàn)頻率小于5%的稀有位點共6個，占全部擴增位點的5.26%.所有用于分析的引物在有效位點上的差異不大，Shannon指數(shù)分析表明不同引物存在非常顯著的多態(tài)性差異，em7-me2引物Shannon指數(shù)最高，為0.581，em8-me6引物則最低，為0.23.這說明em7-me2引物的相關(guān)位點在不同品種中存在很大差異，可以為后期多態(tài)性標記的發(fā)展奠定基礎(chǔ).

表2 SRAP引物組合的遺傳多樣性Tab.2 Genetic diversity of SRAP primers

續(xù)表2

為進一步了解SRAP標記在這些不同來源大麥種質(zhì)間的差異，利用種質(zhì)的來源地點將這些大麥分為不同的群體，進一步展開多態(tài)性分析.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些引物在亞洲來源的大麥中表現(xiàn)出最高的多態(tài)性，歐洲次之(表3).這表明在歐洲和亞洲，大麥品種呈現(xiàn)更為豐富的多樣性.多態(tài)性片段的比例分析表明，亞洲(87.72%)和歐洲(84.21%)的大麥種質(zhì)擁有最高的多態(tài)位點，非洲次之(78.95%)，而美洲則最低(42.98%).

表3 SRAP引物組合在不同地理來源大麥種質(zhì)中的多態(tài)性分析Tab.3 Polymorphism analysis of SRAP primer combinations in different geographical source of barley germplasm

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)分析

利用Arlequin 3.5軟件對不同來源的大麥群體進行AMOVA分析，以進一步了解不同大麥種質(zhì)間遺傳差異的主要來源.結(jié)果顯示種群內(nèi)的基因變化大大豐富了遺傳多樣性(表4).種群內(nèi)的變異數(shù)占總變異的100%，說明這些種質(zhì)間存在的差異全部來源于群體內(nèi).

表4 大麥種質(zhì)群體差異的AMOVA分析Tab.4 AMOVA analysis of the population difference of barley germplasm

以上分析表明大麥種質(zhì)呈現(xiàn)復(fù)雜的遺傳多樣性，而且遺傳差異主要來源于群體內(nèi)，因此為了更清楚地了解群體遺傳結(jié)構(gòu)，利用STRUCTURE軟件進行了混合模型分析.結(jié)果表明，在K=4時，LnP(D)值維持一個高值，表明115份供試的品種可劃分為4個類群，分別對應(yīng)來源于4個洲的大麥品種(圖2).

圖2 115份大麥種質(zhì)的群體遺傳結(jié)構(gòu)Fig.2 Genetic structure of 115 accessions of barley germplasm

2.4 33個國家和地區(qū)大麥種質(zhì)的聚類分析

將115份大麥種質(zhì)按國家和地區(qū)來源不同分為33個群體，在利用GenAlEX 6.5軟件進行遺傳距離運算的基礎(chǔ)上，用MEGA軟件聚類分析(圖3)，在截距0.75處可將33個群體劃分為7個組，分別命名為組A—G.組A包括非洲和美洲的7個國家，組B、C和F只包括中國、日本和韓國各1個亞洲國家，組D包括5個亞洲和非洲國家，組E包括2個亞洲國家，組G則包括所有的15個歐洲國家和亞洲的尼泊爾.

圖3 基于SRAP標記數(shù)據(jù)的不同國家和地區(qū)大麥種質(zhì)資源遺傳距離UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA dendrogram using SRAP allele frequencies data, showing the relationship among the 33 countries and regions of barley

3 討論

種質(zhì)資源研究是展開育種改良工作的基礎(chǔ)，遺傳基礎(chǔ)狹窄會導致難以培育出突破性品種.因此分析種質(zhì)資源的遺傳多樣性，比較種質(zhì)資源間親緣關(guān)系的遠近，對于育種工作具有重要的意義.SRAP標記具有簡單性、可靠性、靈活性、可以檢測多個基因位點以及成本低廉等優(yōu)勢，目前被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析.如郭蕾蕾[19]利用SRAP技術(shù)共標記了216對引物，并在親本間進行多態(tài)性篩選，結(jié)果篩出38對SRAP標記，共產(chǎn)生77個SRAP多態(tài)性位點.劉仙俊[20]選用54對SRAP引物對親本進行多態(tài)性篩選，其中21對SRAP引物在群體中擴增出52個清晰且有差異的位點.

本研究利用7個正向引物和9個反向引物組成的17對SRAP引物組合對115份世界大麥種質(zhì)進行多態(tài)性分析，共擴增出114個多態(tài)條帶，平均每對引物檢測到6.3個等位變異，變異范圍為3～10；Shannon’s多樣性指數(shù)平均為0.430 6，屬于具有較高多態(tài)性的位點.多樣性指數(shù)和等位變異數(shù)低于前人利用SSR標記研究的結(jié)果[21]，其可能原因在于SRAP標記與SSR標記擴增產(chǎn)物不同，SRAP擴增基因區(qū)域不能揭示非基因區(qū)域的遺傳多樣性，而SSR可擴增大麥基因區(qū)和非基因區(qū)，所揭示的是大麥基因組整體的遺傳多樣性水平.以上結(jié)果表明，33個國家的115份大麥材料具有較高的遺傳多樣性，能夠很好地反映這些大麥品種間的遺傳特性，是進行大麥遺傳改良的豐富基因庫.

從大麥種質(zhì)不同洲際間的遺傳多樣性分析可以看出，亞洲種質(zhì)資源的遺傳多樣性Shannon指數(shù)最高，其次是歐洲，而北美洲種質(zhì)資源遺傳多樣性最低，這可能與樣本的遺傳基礎(chǔ)和所處地理位置有關(guān).國際大麥遺傳學界普遍認同大麥的起源中心為中東-肥月亮灣地區(qū)，最近的研究發(fā)現(xiàn)中國西藏野生大麥和中東野生大麥是兩個獨立起源進化的群體，而中國栽培大麥的起源分支源于西藏野生大麥，從而證實了栽培大麥西藏起源中心假說[22].本研究也發(fā)現(xiàn)，歐洲和亞洲大麥品種呈現(xiàn)更為豐富的多樣性(表3)，這與前人的結(jié)果相類似，但由于各個國家的大麥樣本量不同，而且之間差異太大，驗證該結(jié)論尚需進一步的研究.

聚類分析是多種種質(zhì)親緣關(guān)系研究中應(yīng)用較多的方法之一，能量化品種之間的差異.本研究通過聚類分析量化了中國和韓國及日本大麥種質(zhì)資源之間的關(guān)系.此外，根據(jù)17對SRAP引物擴增出的多態(tài)位點，將33個國家的大麥群體劃分為7個組，各組在一定程度上反映出品種的地理來源特點.這一結(jié)果與STRUTURE的分析結(jié)果相一致，暗示地理因素是形成物種分化的最直接原因，也是限制物種基因交流的最有效條件.大麥作為自交植物，在傳播、利用和推廣過程中，地理隔離就成為保持品種特性的重要保障.從圖3的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看到，地理位置鄰近地區(qū)的品種總是聚集在同一類群，例如組G中的歐洲大麥種質(zhì)和組A中非洲大麥種質(zhì).來自北美的5份大麥種質(zhì)和非洲的大麥種質(zhì)聚在一組，說明美洲和非洲的大麥種質(zhì)具有較近的親緣關(guān)系.亞洲國家尼泊爾的大麥種質(zhì)與歐洲15國的大麥種質(zhì)聚為一類，這為研究歐洲大麥種質(zhì)的起源和傳播具有一定的借鑒意義.另外，雖然中國、韓國、日本3國之間的距離很近，但各自聚為一類.此外，Mantel測驗表明供試種質(zhì)遺傳差異并不與物理分割呈現(xiàn)相關(guān)性，這暗示著引種等人類活動會對大麥種質(zhì)多樣性產(chǎn)生巨大影響.然而，大麥種質(zhì)呈現(xiàn)的復(fù)雜性及各個地區(qū)的巨大差異性還有待深入的研究.

本研究利用SRAP分子標記技術(shù)對來自33個國家和地區(qū)的115份大麥種質(zhì)資源進行遺傳多樣性研究，結(jié)果表明來自亞洲和歐洲的大麥具有更多的多態(tài)性位點，遺傳多樣性最為豐富且115份樣本的遺傳差異均來自群體內(nèi)部.聚類分析結(jié)果顯示來源地相同的大麥品種間親緣關(guān)系更近，這與實際情況一致.所得結(jié)果揭示了不同來源的大麥品種間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性差異及其來源，有利于初步了解大麥的遺傳背景，并為大麥育種的改良工作提供了理論依據(jù).