劉 瑋， 李 琳， 劉佳妮， 石 晶， 洪 畋， 陳秀娟

（武漢市中心醫(yī)院老年科，湖北武漢430014）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，預(yù)防AS的形成是防治心血管病的根本措施。AS的基因治療是目前研究的熱點，但仍還處于起步階段。調(diào)控AS發(fā)生發(fā)展的基因數(shù)量眾多，機(jī)制復(fù)雜，因此尋找更多更有效的基因治療靶點尤為重要。Klotho（KL）基因是Kuro-o等［1］在1997年發(fā)現(xiàn)的與衰老相關(guān)的新基因，KL基因敲除小鼠可呈現(xiàn)出類似人類衰老的各種表型，如壽命縮短、動脈硬化、不育癥、骨質(zhì)疏松、皮膚萎縮、肺氣腫等［1］。大量研究表明，KL蛋白具有一定的抑制AS的作用［2-5］，但其具體機(jī)制尚不明確。

膽固醇的代謝異常將導(dǎo)致單核-巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的蓄積，從而形成泡沫細(xì)胞，而泡沫細(xì)胞的形成是AS形成早期的標(biāo)志性事件。KL蛋白可否調(diào)控泡沫細(xì)胞形成以及相關(guān)的分子機(jī)制目前國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。?；o酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1（acyl-coenzyme A：cholesterol acyltransferase 1，ACAT1）是細(xì)胞內(nèi)唯一催化長鏈脂肪酸和游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）酯化形成膽固醇酯（cholesterol ester，CE）的關(guān)鍵酶。而由ACAT1合成的CE在細(xì)胞內(nèi)大量蓄集是動脈粥樣硬化灶中泡沫細(xì)胞形成的主要特征。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體家族（ATP-binding cassette transporters，ABCs）中的ABCA1是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出的關(guān)鍵因子［6］。本研究通過觀察可溶性KL蛋白對THP-1源性巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出、THP-1源性泡沫細(xì)胞形成及ACAT1和ABCA1表達(dá)的影響，探討可溶性KL蛋白是否通過調(diào)控ACAT1和ABCA1的表達(dá)，從而影響巨噬細(xì)胞內(nèi)CE蓄積和膽固醇流出，抑制泡沫細(xì)胞形成，從而發(fā)揮抗AS的作用。

材料和方法

1 材料

THP-1單核細(xì)胞株購自ATCC。細(xì)胞膽固醇檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；油紅O和［3H］-膽固醇（Sigma）；TRIzol（Ambion）；SYBR Green PCR試劑盒（KAPA Biosystems）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）；ACAT1及 ABCA1抗體（Abcam）；GAPDH抗體（CST）；氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗（Bioswamp）；佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）購自Gene Operation。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 THP-1細(xì)胞株按ATCC的說明進(jìn)行培養(yǎng)和傳代，加入含160 nmol/L PMA的低血清培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)胞貼壁狀態(tài)，確定THP-1單核細(xì)胞已誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞。換用含80 mg/L ox-LDL的低血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察泡沫細(xì)胞形成。細(xì)胞分為陰性對照組（THP-1巨噬細(xì)胞組）、陽性對照組（THP-1泡沫細(xì)胞組）和不同濃度KL蛋白組（THP-1源性巨噬細(xì)胞經(jīng)25、50、100和200 μg/L［7］的重組KL蛋白預(yù)處理后2 h后，再按照THP-1泡沫細(xì)胞組程序操作）。

2.2 油紅O染色 各組細(xì)胞均加入4%多聚甲醛固定10～15 min，加入油紅O染液染色10 min，再用蘇木素染液復(fù)染2～3 min，然后雙蒸水沖洗并封片，在顯微鏡鏡下觀察，可觀察到細(xì)胞內(nèi)脂滴呈紅色，而細(xì)胞核呈藍(lán)色。

2.3 膽固醇流出率測定［8］THP-1細(xì)胞與［3H］標(biāo)記的膽固醇共同孵育24 h后裂解細(xì)胞，用液體閃爍計數(shù)儀檢測培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解物中［3H］標(biāo)記的膽固醇水平，膽固醇流出率（%）=培養(yǎng)液放射強度/（培養(yǎng)液放射強度+細(xì)胞裂解物放射強度）×100%（放射強度的單位為cpm，即min-1）。

2.4 細(xì)胞內(nèi)總膽固醇（total cholesterol，TC）、FC及CE含量的測定 離心法收集各組細(xì)胞后，用PBS漂洗3次，用超聲破碎細(xì)胞后，按細(xì)胞膽固醇檢測試劑盒的說明操作，用酶熒光學(xué)法分別測定細(xì)胞內(nèi)FC和TC的含量。CE為TC與FC的差值。CE占TC達(dá)到50%以上的細(xì)胞可認(rèn)為已轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞。

2.5 Western blot法檢測ACAT1和ABCA1蛋白的表達(dá) 離心法收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，并用BCA法測定蛋白質(zhì)的濃度，用9%SDSPAGE進(jìn)行電泳分離，每孔上樣量為20μg，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，封閉，加Ⅰ抗及HRP標(biāo)記的Ⅱ抗，用ECL顯影液進(jìn)行熒光顯色，然后將膜放置于全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中進(jìn)行檢測。實驗結(jié)果采用TANON GIS軟件讀取條帶灰度值；將各組的ACAT1和ABCA1分別與相應(yīng)GAPDH的面積灰度值進(jìn)行比較，二者的比值代表ACAT1和ABCA1蛋白的表達(dá)。

2.6 RT-qPCR法檢測ACAT1和ABCA1 mRNA的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，按TRIzol試劑盒的說明提取總RNA，消除所提取的總RNA中的DNA及并除去DN-ase1后，取500 ng總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再取2.5μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR循環(huán)。采用Real-Time System熒光定量PCR儀（BIO-RAD）進(jìn)行反應(yīng)。ACAT1的上游引物序列為5′-GCTGCTCTGGTTCTCAT-3′，下游引物序列為5′-GGCTTCATTTACTTCCC-3′，擴(kuò)增片段大小195 bp；ABCA1的上游引物序列為5′-GAGGTTGCTGCTGTGGA-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-GGCATGGCTTTATTTGG-3′，擴(kuò)增片段大小165 bp；βactin的上游引物序列為5′-TGCCCATCTACG-3′，下游引物序列為5′-TGTCACGCACGATTTCC-3′，擴(kuò)增片段大小153 bp。反應(yīng)程序：95℃3 min；95℃5 s，56℃ 10 s，72℃ 25 s，39 cycles；65℃ 5 s；95℃ 50 s。數(shù)據(jù)采用儀器自帶的qbase+軟件分析。β-actin為內(nèi)參照，運用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參照；ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，相關(guān)的濃度劑量效應(yīng)關(guān)系采用線性相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 油紅O染色觀察可溶性KL蛋白對THP-1源性泡沫細(xì)胞形成的影響

油紅O染色鏡下觀察，陰性對照組的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未見明顯的紅色脂滴，而在陽性對照組的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可觀察到大量的紅色脂滴，符合泡沫細(xì)胞的形態(tài)特點。與陽性對照組相比，不同濃度KL蛋白組中，隨著可溶性KL蛋白濃度的增高，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)紅色脂滴數(shù)量呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢，見圖1。

Figure 1.Lipid droplets in THP-1 cells detected by oil red Ostaining.A：negative control group（THP-1-derived macrophages）；B：positive control group（THP-1-derived foam cells in the presence of ox-LDL）；C～F：THP-1-derived macrophages were pretreated with soluble Klotho protein（25，50，100 and 200 μg/L）for 2 h，and then treated with ox-LDL for 48 h.The scale bar=20μm.圖1 油紅O染色觀察各組細(xì)胞胞漿內(nèi)脂滴的變化

2 可溶性KL蛋白對膽固醇酯合成的影響

酶熒光學(xué)法檢測顯示，陰性對照組細(xì)胞內(nèi)CE/TC比值＜50%；而陽性對照組的CE/TC比值＞50%，符合泡沫細(xì)胞的生化特點；與陽性對照組相比，不同濃度KL蛋白組細(xì)胞內(nèi)TC和CE的含量隨著可溶性KL蛋白濃度的增高逐漸降低（相關(guān)系數(shù)r分別為-0.95和-0.96，均P＜0.05），當(dāng)KL蛋白濃度為50、100和200μg/L時，CE/TC比值均小于50%，并且呈逐漸遞減的趨勢，見表1。

3 可溶性KL蛋白對膽固醇流出的影響

液體閃爍計數(shù)法顯示，陽性對照組細(xì)胞膽固醇流出率與陰性對照組相比明顯降低（P＜0.05）；與陽性對照組相比，不同濃度KL蛋白組隨著可溶性KL蛋白濃度的增高，膽固醇流出率逐漸升高，當(dāng)KL蛋白濃度為50、100和200μg/L時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

4 可溶性KL蛋白對ACAT1和ABCA1蛋白表達(dá)的影響

陽性對照組的ACAT1蛋白表達(dá)與陰性對照組相比明顯上調(diào)（P＜0.05）；不同濃度KL蛋白組與陽性對照組相比，隨著KL蛋白濃度的增高，細(xì)胞內(nèi)ACAT1蛋白表達(dá)逐漸降低（r=-0.92，P＜0.05），見圖2。

與陰性對照組相比，陽性對照組ABCA1的蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；不同濃度KL蛋白組與陽性對照組相比，隨著KL蛋白濃度的增高（從25μg/L到100μg/L），細(xì)胞內(nèi)ABCA1蛋白表達(dá)逐漸增多（P＜0.05），而200μg/L KL組與100μg/L KL組相比，ABCA1蛋白表達(dá)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

表1 可溶性KL蛋白對各組細(xì)胞TC、FC和CE含量的影響Table 1.Effects of soluble Klotho（KL）protein on total cholesterol（TC），free cholesterol（FC）and cholesteryl ester（CE）in THP-1-derived macrophages（Mean±SD.n=3）

表2 可溶性KL蛋白對各組細(xì)胞膽固醇流出率的影響Table 2.Effects of soluble Klotho（KL）protein on cholesterol efflux of THP-1-derived macrophages（Mean±SD.n=3）

5 可溶性KL蛋白對ACAT1和ABCA1 mRNA表達(dá)的影響

陽性對照組ACAT1 mRNA的表達(dá)與陰性對照組相比顯著上調(diào)（P＜0.05）；不同濃度KL蛋白組與陽性對照組相比，隨著KL蛋白濃度的增高，細(xì)胞內(nèi)ACAT1 mRNA的表達(dá)逐漸降低（r=-0.94，P＜0.05），見圖3A。與陰性對照組相比，陽性對照組ABCA1 mRNA的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；不同濃度KL蛋白組與陽性對照組相比，隨著KL蛋白濃度的增高，細(xì)胞內(nèi)ABCA1 mRNA的表達(dá)逐漸增多（r=0.88，P＜0.05），見圖3B。

討 論

膽固醇酯在巨噬細(xì)胞內(nèi)大量蓄集并形成泡沫細(xì)胞是AS早期病變的典型病理特征。在AS的形成過程中，膽固醇代謝異常是一個重要環(huán)節(jié)，ACAT1和ABCA1在此環(huán)節(jié)中扮演了角色，ACAT1主要負(fù)責(zé)膽固醇酯的合成，而ABCA1主要負(fù)責(zé)膽固醇的流出。ACAT1是細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯合成的關(guān)鍵酶，調(diào)節(jié)著游離膽固醇和膽固醇酯之間的平衡。研究顯示，在THP-1源性巨噬細(xì)胞中過表達(dá)ACAT1將促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成［9］，而ACAT1反義寡核苷酸及ACAT1抑制劑可抑制泡沫細(xì)胞形成［10］。ABCA1可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)磷脂和游離膽固醇轉(zhuǎn)運至載脂蛋A1，從而促進(jìn)高密度脂蛋白生成，啟動膽固醇逆向轉(zhuǎn)運過程，在機(jī)體清除多余脂質(zhì)的過程中發(fā)揮重要作用［11-12］。

人類的KL基因可以通過不同的拼接方式選擇性拼接而產(chǎn)生兩種蛋白產(chǎn)物：分泌型KL蛋白和膜型KL蛋白。分泌型KL可以作為一種內(nèi)分泌激素或內(nèi)循環(huán)因子，通過細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)相應(yīng)的靶基因表達(dá)，從而發(fā)揮其生物學(xué)作用［13-14］。KL基因缺陷小鼠在4周齡大小就開始出現(xiàn)動脈粥樣硬化的征象，并能隨著增齡而逐漸加重。而將外源性KL基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入KL基因缺陷的小鼠體內(nèi)后，其動脈粥樣硬化程度可得到顯著改善［15］。并且，體外轉(zhuǎn)染外源性KL基因能減輕大鼠心肌細(xì)胞的缺血再灌注損傷［16］。Junsuke等［17］觀察到KL可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的氧化應(yīng)激從而改善內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。我們前期的研究也表明，老年冠心病患者的血漿KL蛋白水平與冠脈狹窄程度呈負(fù)相關(guān)［18］。上述研究表明，KL蛋白具有抑制動脈粥樣硬化進(jìn)程的作用。然而，KL蛋白抑制動脈粥樣硬化的相關(guān)機(jī)制尚不明確，對泡沫細(xì)胞形成的影響及相關(guān)機(jī)制尚無相關(guān)報道。本研究分別從泡沫細(xì)胞的形成、細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出、ABCA1及ACAT1蛋白質(zhì)表達(dá)和mRNA表達(dá)水平探討了可溶性KL蛋白對THP-1單核細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成中ABCA1和ACAT1表達(dá)的影響。實驗結(jié)果表明，在ox-LDL的刺激下，發(fā)生THP-1巨噬細(xì)胞的泡沫化（陽性對照組），ACAT1蛋白及mRNA表達(dá)均顯著增加，而ABCA1蛋白及mRNA表達(dá)均顯著降低。加入外源性的可溶性KL蛋白后，隨著可溶性KL蛋白濃度的升高，THP-1巨噬細(xì)胞泡沫化的程度逐漸減輕，膽固醇的流出逐漸增加。且可溶性KL蛋白能夠呈濃度依賴性的抑制ox-LDL誘導(dǎo)的泡沫細(xì)胞形成過程中，ACAT1蛋白及mRNA表達(dá)的上調(diào)以及ABCA1蛋白及mRNA表達(dá)的下調(diào)，說明可溶性KL蛋白作為一種內(nèi)循環(huán)因子，可能通過調(diào)控巨噬細(xì)胞內(nèi)ACAT1及ABCA1的表達(dá)，進(jìn)而減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇的蓄積，抑制THP-1源性泡沫細(xì)胞形成。

Figure 2.The protein expression of ACAT1 and ABCA1 in each group detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs negative control group；#P＜0.05 vs positive control group.圖2 Western blot檢測各組ACAT1和ABCA1的蛋白表達(dá)

Figure 3.The mRNA expression of ACAT1（A）and ABCA1（B）in each group detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs negative control group；#P＜0.05 vs positive control group.圖3 RT-qPCR檢測各組ACAT1和ABCA1的mRNA表達(dá)

綜上所述，ACAT1和ABCA1是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝的2個關(guān)鍵蛋白，分別調(diào)控膽固醇的合成和流出，可溶性KL蛋白通過抑制ACAT1表達(dá)，促進(jìn)ABCA1表達(dá)，抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的蓄積，增加膽固醇的流出，進(jìn)而阻礙泡沫細(xì)胞的形成，抑制AS的發(fā)生、發(fā)展。我們初步探討了在體外細(xì)胞實驗中，能否通過加入外源性分泌型KL基因的方法，從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控ABCA1和ACAT1的表達(dá)，從而抑制泡沫細(xì)胞形成。