郝璐 陳秋燕 余丹丹 周慶

【摘要】目的 探究新生兒腸道耐藥菌株基因的檢測，并探究耐藥菌株基因的變異起源。方法 選擇天津市中心婦產(chǎn)醫(yī)院經(jīng)剖宮產(chǎn)出生的新生兒作為研究對象，采用PCR技術及相關技術對新生兒出生后3 h的第一次糞便、出生后72h的糞便、母親羊水、母親初乳及所處環(huán)境中的菌株及基因進行檢測，記錄在各樣本中檢測出的菌株及相關的耐藥基因。結果 在新生兒出生后72 h的糞便、母親初乳及新生兒所處的環(huán)境中均能夠檢測中大量的耐藥菌株和耐藥基因，這些耐藥菌株對復方新諾明、盤尼西林、四環(huán)素的耐藥率均高達45%以上，同時新生兒糞便中能夠檢測出很多四環(huán)素類抗性基因tetB、tetM、tetQ及大環(huán)內酯類抗性基因ermB和ermF在內的耐藥基因，另外，新生兒第一次糞便、出生后72 h的糞便以及母親初乳等檢測樣品含有較多的共有菌屬。結論 新生兒腸道菌群的定植是從胎兒時期便開始的，胎兒和母體子宮內的少量微生物密切接觸，在胎兒娩出之后，新生兒所處的環(huán)境中的微生物同樣會對其腸道內微生物的定植產(chǎn)生影響，另外在母乳喂養(yǎng)新生兒的過程中，母乳中的微生物對于新生兒腸道菌群的影響也十分明顯。母親初乳以及環(huán)境中的微生物均對與新生兒腸道耐藥菌株基因變異有影響，其中母親初乳對新生兒腸道耐藥菌株基因變異的影響則更加明顯。因此我們需要從源頭上開始來對母體抗生素的使用進行規(guī)范，減少耐藥菌在環(huán)境以及母體內的擴散，從而降低耐藥菌對幼兒造成的健康威脅。

【關鍵詞】新生兒;腸道耐藥菌株;基因變異起源

【中圖分類號】R722 【文獻標識碼】A 【文章編號】ISSN.2095.6681.2020.8..03

【Abstract】Objective To explore the detection of the gene of intestinal drug-resistant strains in neonates， and to explore the variation origin of the gene of drug-resistant strains.Methods The first feces， feces， amniotic fluid， colostrum and genes in the environment of newborn were detected by PCR and related technologies，and the strains and genes detected in each sample were recorded.Results A large number of drug-resistant strains and genes can be detected in feces， colostrum and environment of the newborn 72 hours after birth. The drug-resistant rates of these drug-resistant strains to cinopramine，penicillin and tetracycline are all over 45%.At the same time， many tetracycline resistant genes tetb，tetm， tetq and macrolide resistant genes e can be detected in feces of the newborn In addition， the first feces of newborn， feces of 72 hours after birth and colostrum of mother contain more common bacteria.Conclusion The colonization of the intestinal flora of the newborn starts from the fetal period. The fetus and a small number of microorganisms in the maternal uterus are in close contact. After the delivery of the fetus，the microorganisms in the environment of the newborn will also have an impact on the colonization of the intestinal flora of the newborn.In addition， during the process of breastfeeding the newborn， the microorganisms in the breast milk will also have an impact on the intestinal flora of the newborn It is obvious.The mother colostrum and the microorganism in the environment all have influence on the gene variation of the intestinal drug-resistant strains of the newborn，and the mother colostrum has more obvious influence on the gene variation of the intestinal drug-resistant strains of the newborn.Therefore， we need to start from the source to regulate the use of maternal antibiotics，reduce the spread of drug-resistant bacteria in the environment and the mother， so as to reduce the health threat of drug-resistant bacteria to children.

【Key words】Newborn;Intestinal resistant strains;Origin of gene variation

1 耐藥菌對人體的危害

耐藥菌，顧名思義就是指對抗生素不敏感甚至完全喪失敏感性的細菌，它的出現(xiàn)使得抗生素對細菌的治療效果完全喪失，增加了感染性疾病的治療難度。在人類發(fā)現(xiàn)青霉素以來，抗生素在人類的應用越來越廣泛，這就使得細菌的耐藥性逐年增加?，F(xiàn)階段，臨床上應用的抗生素種類超過200中，平均每年會增加10中以上，但是由于抗生素在疾病治療、畜牧養(yǎng)殖等領域的濫用，使得每個抗生素投入使用幾年時間內，便會出現(xiàn)相應的耐藥微生物。研究人員指出，倘若臨床繼續(xù)濫用抗生素，且人們沒有研發(fā)出新的抗生素，那么很多感染性疾病將面臨無藥可治的窘境，人類也將回到青霉素未被發(fā)明的日子。

2 人類腸道中的耐藥菌和耐藥基因

研究表明，當前在人的整個發(fā)育階段均可發(fā)現(xiàn)耐藥菌的身影，這對人類的健康產(chǎn)生了極大的威脅，一旦人體步入老年或者免疫力低下時，機體發(fā)生感染的概率便大大增加。當前，耐藥菌在成人和兒童腸道內均能夠分離出來，通過分析0～5歲的兒童糞便可以發(fā)現(xiàn)，分離出產(chǎn)ESBLs腸桿菌科達到59%，每一株菌至少對兩種抗生素耐藥，同時，在這些檢出的菌株中，喹諾酮類耐藥基因qnr、氨基糖苷類耐藥基因aac（6）-ib攜帶率分別高達66%和43%。有學者對4～12個月正常兒童進行大腸桿菌的分離以及耐藥菌測試，結果顯示分離出的大腸桿菌對復方新諾明、盤尼西林、四環(huán)素的耐藥率均高達45%以上。同時，借助PCR技術來對兒童糞便中的菌群進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)很多四環(huán)素類抗性基因tetB、tetM、tetQ及大環(huán)內酯類抗性基因ermB和ermF在內的耐藥基因。

研究表明，新生兒腸道菌群的定植從胎兒時期便已開始，胎兒首先和母體子宮內的少量微生物接觸。在胎兒娩出后，新生兒腸道內的微生物環(huán)境會和其密切接觸的外環(huán)境之間產(chǎn)生影響。對于正常順產(chǎn)的新生兒，其腸道內微生物菌群可能隨著母體陰道以及乳液中的微生物進行傳輸，而對于剖宮產(chǎn)的新生兒，其腸道內微生物族群可能來自其與環(huán)境密切接觸的微生物。新生兒倘若通過母乳進行喂養(yǎng)，那么母乳中的微生物對新生兒的腸道菌群具有十分密切的影響。有研究指出，部分新生兒胎便中可檢測到葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌以及多種四環(huán)素類及β-內酰胺類耐藥基因，這就意味著耐藥菌在新生兒腸道菌群形成初期就已經(jīng)伴隨著正常菌群進入腸道之中。

3 新生兒腸道及糞便耐藥基因檢測

人體的腸道包含著各種各樣的微生物，參與人體的正常生理活動，并直接影響著人體的健康，但是隨著近年來抗生素的大量食用，很多兒童腸道內定植了大量的抗生素耐藥菌甚至多重耐藥菌，造成各種感染性疾病，嚴重威脅人類的健康。新生兒腸道菌群建立的過程中，由于接觸外界環(huán)境以及外界輸出，使得這些菌群在腸道內定植下來，但是倘若新生兒接觸的環(huán)境中存在耐藥菌，那么這些耐藥菌很有可能隨著正常的微生物進入到腸道之中，穩(wěn)定且長期存在，甚至作為人體腸道的共生菌持續(xù)的存在于人體腸道當中。

在進行新生兒腸道和糞便耐藥基因的檢測時，選擇天津市中心婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)科的剖宮產(chǎn)新生兒，新生兒不存在基礎疾病，無抗生素應用史。

在進行本次研究時，將新生兒出生后3 h的第一次糞便以及出生后72h的糞便進行采集，作為本次研究樣品，在新生兒排便于紙尿褲上后，通過糞便采集管收集2 g左右的糞便，選擇中間的固體部分并置于冰盒當中，迅速送往實驗室。其次還要進行母體羊水以及初乳的采集。在母親行剖宮產(chǎn)手術時，由手術醫(yī)師在無菌操作下采集10 mL羊水，同樣放入冰盒后送往實驗室。初乳的采集也是一樣，在采集前需要用碘伏及酒精對乳頭進行消毒。另外，還需要對空氣中的微生物進行采集。在進行微生物的采集時，選擇3個病房，每個病房選取三個部位放置BHI培養(yǎng)皿，在空氣中暴露20 min，收集完畢后置入冰盒，送往實驗室后保持環(huán)境溫度37℃，培養(yǎng)24 h。

在完成樣品的采集之后，對新生兒胎便中的菌群數(shù)量進行計數(shù)，并通過PCR技術來對新生兒胎便中的耐藥基因進行檢測，并建立耐藥基因的標準曲線。其次，對接觸環(huán)境樣品中的耐藥基因進行PCR技術檢測，統(tǒng)計并記錄其初乳中的均落數(shù)量和耐藥基因、接觸空氣中的耐藥基因以及羊水中的耐藥基因，并采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件以及x2檢驗來對統(tǒng)計結果進行統(tǒng)計學分析。

實驗結果表明，在新生兒第一次糞便中沒有檢出具有統(tǒng)計學意義的微生物數(shù)量，而在72h后的糞便中，可以發(fā)現(xiàn)有99%的細菌是不可培養(yǎng)的。在第一次新生兒糞便檢測中，沒有檢測出明顯的耐藥基因，而在第二次糞便檢測中，已經(jīng)能夠發(fā)現(xiàn)多種類型的耐藥基因。單一耐藥基因占所有研究對象的27.7%，兩種耐藥基因的糞便占所有研究對象的37.8%，三種耐藥基因糞便數(shù)量占所有研究對象的17.1%，本次檢測中，糞便中最多有四種耐藥基因，占所有研究對象的8.5%。

同時，針對母親初乳、羊水以及接觸環(huán)境的檢測表明，在母乳中可以檢測出豐富的耐藥基因，其中含有一種耐藥基因的樣品31.1%，含有兩種耐藥基因的樣品占比高達40以上，最多可檢測中含有四種耐藥基因的母乳樣品3.3%。而在所獲得的的羊水樣本中，并沒有檢測到微生物，同時也沒有檢測到相應的耐藥基因，這說明在進行羊水取樣時沒有出現(xiàn)污染，同時羊水不會對新生兒腸道耐藥菌群的定植提供支持和運輸。另外，在對所接觸空氣的微生物進行培養(yǎng)之中，檢測出其中有四種耐藥基因，分別為ampC、mecA、ermB、tetW，其中檢出率最高的耐藥基因為ampC，檢出率高達41.7%。

本次實驗結果表明，新生兒第三天的糞便中已經(jīng)含有多種類型的耐藥基因，這些耐藥基因完全覆蓋了現(xiàn)階段人類常使用的五大抗生素，即β-內酰胺類、氨基糖苷類、大環(huán)內酯類、磺胺類及四環(huán)素類，其中β-內酰胺類抗生素的耐藥基因檢測率最高。在新生兒第三天的糞便中便可檢測中基因，這就意味著新生兒的腸道耐藥基因污染已經(jīng)十分明顯，可以考慮是羊水、母乳以及空氣中微生物的定植所致。

對于母親羊水的檢測結果提示，羊水中并未檢測中明顯的微生物以及抗生素耐藥基因，可以考慮在本次研究的環(huán)境下可培養(yǎng)的菌并為來自母親羊水，但是本次研究也不能完全排除不可培養(yǎng)的細菌或耐藥基因通過羊水傳遞給新生兒。而對母親初乳和空氣的檢測提示可檢測中多種耐藥基因，尤其是母親初乳，所監(jiān)測的耐藥基因均有不同的檢出率。

4 新生兒腸道耐藥菌株基因變異分析

在進行新生兒腸道耐藥菌株基因變異的分析時，在全基因組水平研究基因突變導致腸道耐藥菌株產(chǎn)生的分子機制十分有必要。通過給予深度測序的雙重測序和BS測序技術，能夠借助測序檢測基因突變和基因表觀修飾變化，并開發(fā)出相應的數(shù)據(jù)分析算法。

選擇20組正常的足月新生兒和母親，采集羊水、新生兒的第一次糞便、第三天糞便。

對于獲取的羊水樣本，采用十六烷基三甲基溴化銨法來進行基因組DNA的提取，然后用特異性引物將基因特定的V3-V4區(qū)進行擴增，獲取印務序列。將PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，調整其濃度，并將目的條帶使用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。再使用Q-PCR定量來進行測序，將測序后的數(shù)據(jù)刪除其標簽和引物序列，使用flash技術對樣品的序列進行拼接，得到初始的tags，將獲取的tags序列和數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，最終得到有效的數(shù)據(jù)。

研究結果顯示，新生兒第一次糞便、新生兒第三天糞便、母親初乳以及羊水這四種樣品中均含有較多的細菌，按照門水平，可以發(fā)現(xiàn)四組樣品中海油擬桿菌門、放線菌門及變形菌門，而按照屬進行分類，可以發(fā)信啊四組樣品中含有較多的鹽單胞菌、不動桿菌以及希瓦氏菌。同時，這四組樣品中均含有較多的共有菌屬，這就意味著新生兒腸道菌群既來自于母親的羊水，也來自于母親的初乳。

同時，Amova分析結果顯示，母親羊水和新生兒第一次糞便中的菌群一致，因此，本次研究結果表明，新生兒在胎兒時期就接受了羊水中的菌群，并且這些菌群在胎兒時期便在腸道內定制。但是兩組樣品中都沒有檢測出細菌或者耐藥基因，考慮這些檢測出的細菌不具有培養(yǎng)性，或者說本次研究提供的培養(yǎng)環(huán)境不適合以上細菌的培養(yǎng)。同時，本次研究表明，母親初乳中檢測出較多的耐藥基因以及細菌，說明母親初乳是新生兒腸道耐藥菌株變異的重要來源。

參考文獻

[1] 張坤明.新生兒腸道耐藥基因調查及來源研究[D].廣西醫(yī)科大學，2017.

[2] 滑心恬，唐 軍，母得志.NICU早產(chǎn)兒腸道耐藥菌定植情況及其影響因素分析[J].四川大學學報（醫(yī)學版），2015，46（02）：318-320+330.