陳麗莉 陳建安 朱學(xué)海 余暉 丁茜 劉曉彤

【摘要】 目的：探討對不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的淋巴細(xì)胞免疫治療效果具有預(yù)評估價值的指標(biāo)，為免疫治療提供臨床參考。方法：選取2016年10月-2018年10月在筆者所在醫(yī)院就診并自愿接受淋巴細(xì)胞免疫治療的不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者94例，比較相同治療周期時，封閉抗體轉(zhuǎn)為強陽性組與弱陽性組在治療前外周血淋巴細(xì)胞亞群比例和治療后兩組的再發(fā)自然流產(chǎn)率差異;比較不同治療周期時，封閉抗體經(jīng)一療程治療轉(zhuǎn)為陽性組與兩療程治療轉(zhuǎn)為陽性組的再發(fā)自然流產(chǎn)率差異。結(jié)果：相同治療周期，封閉抗體強陽性組治療前CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例高于弱陽性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;封閉抗體強陽性組在孕16周前再發(fā)自然流產(chǎn)率低于弱陽性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;不同治療周期，封閉抗體經(jīng)一療程治療轉(zhuǎn)為陽性組與兩療程治療轉(zhuǎn)為陽性組在孕16周前的再發(fā)自然流產(chǎn)率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：外周血CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞可預(yù)評估免疫治療后封閉抗體的陽性強度，而封閉抗體陽性強度與孕16周前的再發(fā)自然流產(chǎn)率相關(guān)。暫未發(fā)現(xiàn)封閉抗體轉(zhuǎn)為陽性的治療周期對孕16周前的再發(fā)自然流產(chǎn)率具有預(yù)評估價值。

【關(guān)鍵詞】 封閉抗體 淋巴細(xì)胞亞群 不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn) 淋巴細(xì)胞免疫治療

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.12.006 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1674-6805（2020）12-00-03

Study on the Pre-evaluation Index of Lymphocyte Immunotherapy in Patients with Unexplained Recurrent Spontaneous Abortion/CHEN Lili， CHEN Jianan， ZHU Xuehai， YU Hui， DING Qian， LIU Xiaotong. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（12）： -16

[Abstract] Objective： To explore the indexes of pre-evaluation for lymphocyte immunotherapy in patients with unexplained recurrent spontaneous abortion， and to provide clinical reference for immunotherapy. Method： From October 2016 to October 2018 in our hospital， 94 cases of patients with unexplained recurrent spontaneous abortion voluntarily accepted the lymphocyte immune treatment were selected. In the same treatment cycle，the differences in the proportion of peripheral blood lymphocyte subsets before treatment and the rate of recurrent spontaneous abortion after treatment were compared between the strongly and the weakly positive group with blocking antibody. In the different treatment cycle， the rate of recurrent spontaneous abortion in the positive group with blocking antibody after one course of treatment and the positive group after two courses of treatment were compared. Result： With the same treatment cycle， the proportion of CD3+CD8+T lymphocytes before treatment in the strongly positive group with blocking antibody was higher than that in the weakly positive group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The rate of recurrent spontaneous abortion in the strongly positive group with blocking antibody before 16 weeks of pregnancy was lower than that in the weakly positive group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. With the different treatment cycle， the rate of recurrent spontaneous abortion in the positive group with blocking antibody after one course of treatment and that after two courses of treatment was not statistically significant （P>0.05）. Conclusion： Peripheral CD3+CD8+T lymphocytes can pre-evaluate the positive intensity of blocking antibody after immunotherapy， and the positive intensity of blocking antibody is related to the rate of recurrent spontaneous abortion before 16 weeks of pregnancy. It is not found that the treatment cycle of blocking antibody to positive had a pre-evaluation value on the rate of recurrent spontaneous abortion before 16 weeks of pregnancy.

[Key words] Blocking antibody Lymphocyte subsets Unexplained recurrent spontaneous abortion Lymphocyte immunotherapy treatment

First-authors address： Donghua Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University， Dongguan 523000， China

國內(nèi)多項研究認(rèn)為，丈夫外周血淋巴細(xì)胞免疫治療（lymphocyte immunotherapy treatment，LIT）可用于治療不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）[1-3]，其原理為LIT可誘導(dǎo)母體產(chǎn)生封閉抗體（blocking antibody，BA），BA能抑制母體免疫系統(tǒng)識別和殺傷胚胎，從而產(chǎn)生免疫保護作用[4-5]。盡管LIT的療效得到普遍認(rèn)同，但目前對預(yù)評估LIT療效的指標(biāo)少有報道，而預(yù)評估指標(biāo)可指導(dǎo)治療方案的制定，提高治療效果。因此本次研究擬對筆者所在醫(yī)院自愿接受LIT的URSA患者進行療效追蹤和相關(guān)指標(biāo)回顧分析，旨在研究對LIT的治療效果具有預(yù)評估價值的指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年10月-2018年10月在中山大學(xué)附屬東華醫(yī)院就診且自愿接受LIT的URSA患者94例。納入標(biāo)準(zhǔn)：女方連續(xù)3次以上自然流產(chǎn)且封閉抗體陰性;通過分泌物檢查排除生殖器感染;通過超聲或?qū)m腔鏡排除生殖器異常及其他病變;抗子宮內(nèi)膜抗體、抗卵巢抗體、抗絨毛膜促性腺激素抗體、抗精子抗體、抗心磷脂抗體、抗核抗體、抗雙鏈DNA抗體均為陰性;凝血功能正常。男方精液常規(guī)正常、抗精子抗體為陰性。同時，夫妻雙方的支原體、衣原體、乙肝病毒、HIV、梅毒抗體、TORCH-IgM病毒抗體均為陰性;染色體核型分析正常且非近親結(jié)婚;研究對象以往均未接受過淋巴細(xì)胞主動免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他基礎(chǔ)疾病;通過人工輔助妊娠?；颊吣挲g24～42歲，平均（31.0±4.7）歲，流產(chǎn)3～7次，平均（4.2±0.9）次。治療前夫妻雙方均對LIT充分了解并簽署知情同意書。本次研究通過醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 方法

1.2.1 BA檢測 采集患者肘靜脈血2 ml，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗進行外周血BA檢測，每次檢測均設(shè)陰性、陽性和空白對照，檢測步驟及結(jié)果判讀嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

1.2.2 外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測 采集患者肘靜脈血2 ml，EDTA-K2抗凝，分別取抗凝全血50 μl加入4個流式細(xì)胞計數(shù)試管中，再往第1管加入CD45-FITC/CD3-PC5/CD8-ECD/CD4-RD1抗體各5 μl，第2管加入CD45-FITC/CD19-ECD/CD56-RD1抗體各5μl，第3管加入CD45-Cy7/CD4-PE/CD25-FITC抗體各5 μl，第4管加入CD45-FITC/CD3-PC5/CD16-PE/CD56-RD1抗體各5 μl，避光反應(yīng)20 min后，加入紅細(xì)胞裂解液500 μl，避光反應(yīng)20 min后加入PBS緩沖液，用流式細(xì)胞儀分析計算淋巴細(xì)胞亞群比例。

1.2.3 淋巴細(xì)胞免疫治療（LIT） 采集淋巴細(xì)胞供給者外周血30 ml（肝素鈉抗凝），緩緩加入到20 ml淋巴細(xì)胞分離液中，2 000 r/min離心30 min，收集中間層細(xì)胞放入含6 ml生理鹽水的試管中混勻，2 000 r/min離心5 min，棄去上清后用生理鹽水反復(fù)洗滌沉淀物2次，最后配制成濃度為2×107～4×107/ml的淋巴細(xì)胞懸液。取淋巴細(xì)胞懸液在患者手臂內(nèi)側(cè)進行8～10個點皮內(nèi)注射。每3周1次，4次為一個療程，治療一療程后復(fù)查BA，BA轉(zhuǎn)為陽性即指導(dǎo)妊娠，妊娠后每2周進行LIT一次，妊娠10周后調(diào)整治療方案為每3周進行LIT一次，妊娠16周治療結(jié)束。治療一療程后BA仍未轉(zhuǎn)為陽性者，繼續(xù)第二療程治療后再指導(dǎo)妊娠。

1.3 觀察指標(biāo)

分別觀察LIT前患者外周血淋巴細(xì)胞亞群比例與LIT后BA陽性強度;BA陽性強度與LIT后患者再發(fā)自然流產(chǎn)率;BA轉(zhuǎn)為陽性的LIT療程與LIT后患者再發(fā)自然流產(chǎn)率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 相同治療周期BA強陽性組與弱陽性組在治療前外周血淋巴細(xì)胞亞群比例比較

經(jīng)一療程治療后，48例患者的BA轉(zhuǎn)為強陽性，22例患者的BA轉(zhuǎn)為弱陽性，強陽性組治療前CD3+CD8+T細(xì)胞比例高于弱陽性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而兩者的CD3+T、CD3+CD4+T、CD4+CD25+T、CD19+B、CD56+CD16+NK、CD56+CD16-NK等淋巴細(xì)胞比例差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.2 相同治療周期BA強陽性組與弱陽性組再發(fā)自然流產(chǎn)率比較

經(jīng)一療程治療后，BA轉(zhuǎn)為強陽性者占68.6%（48/70），弱陽性者占31.4%（22/70）。BA強陽性組年齡24～40歲，平均（31.1±4.9）歲，流產(chǎn)3～6次，平均（4.2±0.8）次;BA弱陽性組年齡25～42歲，平均（31.5±4.6）歲，流產(chǎn)3～6次，平均（4.3±0.8）次。兩組患者的年齡及流產(chǎn)次數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

BA強陽性組中，36例再次妊娠，其中15例在孕期中且孕周超過16周，15已經(jīng)分娩，2例在孕16周前再次發(fā)生自然流產(chǎn)，1例因染色體異常引產(chǎn)及3例孕周小于16周不列入統(tǒng)計范疇，BA強陽性組孕16周前再發(fā)自然流產(chǎn)率為6.3%（2/32）。BA弱陽性組中，20例再次妊娠，其中9例在孕期中且孕周超過16周，3例已經(jīng)分娩，6例在孕16周前再次發(fā)生自然流產(chǎn)，2例孕周小于16周不列入研究范疇，BA弱陽性組孕16周前再發(fā)自然流產(chǎn)率為33.3%（6/18）。BA強陽性組在孕16周前再發(fā)自然流產(chǎn)率低于BA弱陽性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（字2=4.434，P=0.035）。

2.3 BA一療程轉(zhuǎn)為陽性組與兩療程轉(zhuǎn)為陽性組的再發(fā)自然流產(chǎn)率比較

94例患者中，70例經(jīng)一療程治療后BA轉(zhuǎn)為陽性，22例經(jīng)兩療程治療后BA轉(zhuǎn)為陽性，2例經(jīng)兩療程治療后BA仍為陰性。一療程組年齡24～42歲，平均（31.3±4.5）歲，流產(chǎn)3～6次，平均（4.3±0.8）次;兩療程組年齡25～41歲，平均（30.7±4.3）歲，流產(chǎn)3～7次，平均（4.1±1.0）次，兩組患者的年齡及流產(chǎn)次數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

在BA轉(zhuǎn)為陽性的患者中，一療程組中56例再次妊娠，其中24例在孕期中且孕周超過16周，18例已分娩，8例在孕16周前再次發(fā)生自然流產(chǎn)，1例因染色體異常引產(chǎn)以及5例孕周小于16周均不列入統(tǒng)計范疇，一療程組孕16周前再發(fā)自然流產(chǎn)率為16%（8/50）。兩療程組中16例再次妊娠，其中7例在孕期中且孕周超過16周，5例已分娩，2例在孕16周前再次發(fā)生自然流產(chǎn)，2例孕周小于16周不列入統(tǒng)計范疇，兩療程組孕16周前再發(fā)自然流產(chǎn)率為14.3%（2/14）。兩組患者孕16周前再發(fā)自然流產(chǎn)率相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是臨床常見的婦科疾病，對女性患者帶來極大的身心傷害，現(xiàn)已成為目前醫(yī)學(xué)上急需解決的醫(yī)學(xué)難題之一[6]。在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的眾多病因中，同種免疫異常所占比例最高[7]，同種免疫型復(fù)發(fā)性流產(chǎn)又被稱為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（URSA）。石瑛等[8]通過進行反復(fù)自然流產(chǎn)與BA相關(guān)性的Meta分析，認(rèn)為URSA與BA缺乏有關(guān)。BA是妊娠女性血清中含有的針對胚胎人類白細(xì)胞抗原Ⅱ和滋養(yǎng)細(xì)胞交叉抗原產(chǎn)生的IgG抗體，通過與滋養(yǎng)細(xì)胞結(jié)合或與母體淋巴細(xì)胞表面抗原結(jié)合，防止胚胎父系抗原被母體免疫系統(tǒng)識別觸發(fā)的免疫攻擊[9]。研究顯示，對BA缺乏的URSA患者，經(jīng)LIT治療后，可誘導(dǎo)BA產(chǎn)生，進而提高淋巴細(xì)胞的封閉率，致使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞得到活化和增殖[10]，從而抑制母胎之間的免疫排斥，最終使妊娠率及活產(chǎn)率均顯著升高[11]。然而盡管大多研究證實LIT對URSA患者治療效果明顯[12]，但遺憾的是目前對LIT療效的預(yù)評估缺乏相關(guān)研究，如對LIT療效預(yù)評估指標(biāo)進行探討，則可進一步細(xì)化LIT治療方案，提高治療效果。LIT主要是通過誘導(dǎo)BA產(chǎn)生而發(fā)揮治療效果，但誘導(dǎo)產(chǎn)生的BA的陽性強度差異是否影響再發(fā)自然流產(chǎn)率;BA陽性強度差異的治療前影響因素有哪些;經(jīng)不同治療周期誘導(dǎo)產(chǎn)生BA的患者的再發(fā)自然流產(chǎn)率是否有差異等，這些都是臨床需要探討的問題，同時亦可為預(yù)評估治療效果提供參考。因此本次研究通過對比在相同治療周期內(nèi)，BA轉(zhuǎn)為強陽性組與轉(zhuǎn)為弱陽性組患者在治療前外周血淋巴細(xì)胞亞群比例，發(fā)現(xiàn)前者CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例高于后者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而治療后BA強陽性組在孕16周前的再發(fā)自然流產(chǎn)率低于弱陽性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在不同治療周期內(nèi)，BA經(jīng)一療程治療轉(zhuǎn)為陽性組與兩療程治療轉(zhuǎn)為陽性組患者比較，兩者孕16周前的再發(fā)自然流產(chǎn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

外周血淋巴細(xì)胞亞群是人體細(xì)胞免疫的重要因素，CD3+CD8+T和CD3+CD4+T是T淋巴細(xì)胞的主要組成部分，CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞主要對CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞參與的細(xì)胞免疫產(chǎn)生抑制[13]。本次研究發(fā)現(xiàn)，治療后BA轉(zhuǎn)為強陽性組在治療前CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例高于BA轉(zhuǎn)為弱陽性組，推測CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞可能間接影響B(tài)A的產(chǎn)生，因此推薦治療前使用CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比例預(yù)評估LIT誘導(dǎo)BA產(chǎn)生的陽性強度。BA作為一種體液免疫因素，被認(rèn)為是妊娠成功的一個重要因素[14]。本次研究發(fā)現(xiàn)BA強陽性組孕16周前的再發(fā)自然流產(chǎn)率低于弱陽性組，提示BA的陽性強度與再發(fā)自然流產(chǎn)率相關(guān)，建議LIT后觀察BA的陽性強度，對于BA弱陽性的患者，進行鞏固治療后再指導(dǎo)妊娠，可進一步降低再發(fā)自然流產(chǎn)率。另外，本次研究暫未發(fā)現(xiàn)BA轉(zhuǎn)為陽性的治療周期與孕16周前的再發(fā)自然流產(chǎn)率相關(guān)，治療周期能否預(yù)評估治療效果尚需更多研究數(shù)據(jù)論證。

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（收稿日期：2020-02-21） （本文編輯：張亮亮）