秦燕飛，孫建平，陳佳威，梁蒙，任艷文

（中國長城葡萄酒有限公司技術(shù)中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部釀酒葡萄加工重點實驗室，河北懷來 075400）

軟木塞污染是葡萄酒最嚴(yán)重的感官缺陷之一，造成軟木塞污染的主要成分就是具有強(qiáng)烈泥土/發(fā)霉氣味的2,4,6-三氯苯甲醚（TCA）[1-2]。TCA是由一類生長在軟木塞內(nèi)的霉菌分解其生長環(huán)境中的2,4,6-三氯苯酚而產(chǎn)生的物質(zhì)[3-4]。瓶裝后，經(jīng)木塞遷移到葡萄酒中的TCA比葡萄酒本身還穩(wěn)定，而且痕量（2～10 ng/L）的TCA便會產(chǎn)生令人不悅的氣味[1,5-6]，同時也會干擾消費(fèi)者對其他香氣成分的感知。美國食品藥品監(jiān)督管理局的研究報告表明，TCA的閾值水平一般是3.1 ng/L[7]。根據(jù)測算，全球每年因TCA污染而造成的葡萄酒損失可達(dá)100億美元[8]。

雖然葡萄酒界也在致力于尋找軟木塞的替代者，如高分子材料合成塞、玻璃塞、鋁制螺旋帽等[9]，但它們在一定程度上缺少了葡萄酒長期熟成的有益性和開瓶時的高級感。因此，目前軟木塞仍然是理想的葡萄酒瓶塞。按材料或加工工藝可將軟木塞分為：天然塞（含填充塞）、貼片塞（1+1塞、0+1塞、2+2塞等）、聚合塞、加頂塞[10]，在此基礎(chǔ)上又衍生出微顆粒塞、DIAM塞等[11-12]。

TCA在軟木塞和葡萄酒中的含量都非常低，因此，高效的前處理萃取技術(shù)和靈敏度極高的檢測方法是必不可少的。前處理方法有固相微萃取、液液微萃取和免疫親和固相萃取等[5-6,13]，其中以頂空固相微萃取的使用為主。儀器檢測方法有氣相色譜-電子捕獲檢測器法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法及其他檢測方法（如離子流動性光譜法、酶聯(lián)免疫分析法等）[5-6,14-15]，其中以氣相色譜-電子捕獲檢測器法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的使用為主。目前，對于木塞中TCA的研究多為萃取技術(shù)、檢測方法的優(yōu)化，不同類別軟木塞中TCA的遷移量及相應(yīng)規(guī)律卻鮮有報道。

本研究采用ISO 20752-2014[16]國際通用的檢測方法，即HS-SPME-GC-MS（頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用）法對軟木塞中TCA遷移量進(jìn)行檢測，在建立了成熟穩(wěn)定的檢測方法基礎(chǔ)上，對不同廠家、不同類別的軟木塞進(jìn)行TCA遷移量的檢測和評價分析，旨在對葡萄酒封裝中軟木塞的選擇提供指導(dǎo)，最大程度上降低軟木塞中TCA對葡萄酒的污染。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用軟木塞來自8家不同木塞生產(chǎn)廠和貿(mào)易公司，采樣時間2018年1月—2019年12月，每批次樣品取樣40個，密封包裝后備用。

1.2 試劑與儀器

按照國際ISO方法[16]測定樣品中TCA含量。

1.2.1 試劑

本方法使用符合GB/T 6682規(guī)定的一級水；四無乙醇（色譜純），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；無水乙醇和氯化鈉均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2,4,6-三氯苯甲醚（TCA）標(biāo)品，純度≥99%，Dr.Ehrenstorfer Gmbh；2,4,6-三氯苯甲醚（TCA）-D5標(biāo)品，純度≥98%，Dr.Ehrenstorfer Gmbh。

1.2.2 儀器

島津氣相色譜-質(zhì)譜連用儀（GC-MS 2010Ultra）；SPME固相微萃取裝置；100μm PDMS SPME萃取頭（安譜公司）；低極性石英毛細(xì)管柱：長30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚度0.25μm；固定相為5%二苯基和95%二甲基聚硅氧烷共聚物（RESTEK）；島津不分流、無石英棉襯管；高純氦氣；分析天平：感量 0.01 mg。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液配制

12%（V/V）乙醇溶液用無水乙醇配制。TCA系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、TCA-D5標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制參照ISO方法[16]。

1.3.2 樣品處理

在室溫下將20個軟木塞置于1 L廣口瓶內(nèi)，倒入乙醇溶液直至充滿廣口瓶，浸泡24 h后取出，作為樣品溶液。稱取1.5 g氯化鈉于20 mL頂空樣品瓶中，加入5 mL樣品溶液和0.1 mL的TCA-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液，壓蓋，備用。

1.3.3 頂空固相微萃取

平衡溫度40 ℃，平衡時間5 min，攪拌速度250 r/min；萃取溫度40 ℃，萃取時間30 min；解析溫度250 ℃，解析時間5 min。萃取頭老化溫度260 ℃，老化時間1 min。

1.3.5 氣質(zhì)聯(lián)用儀參數(shù)設(shè)置

進(jìn)樣口溫度：250 ℃。升溫程序：初始柱溫70 ℃，以10 ℃/min升溫至160 ℃，再以25 ℃/min升溫至250 ℃，保持3 min。進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣，1 mL/min。載氣：純氦氣。色譜與質(zhì)譜接口溫度：250 ℃；離子源溫度：230 ℃；溶劑延遲時間7 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測方法的建立

前期已優(yōu)化了萃取條件及儀器參數(shù)，如1.2所示。方法檢出限以信噪比S/N=3表示，對TCA標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋，直至信噪比為3，此時TCA濃度為0.51 ng/L，即為該方法的檢出限。本研究中低于檢出限的均認(rèn)為未檢出。

依照1.3.2配制的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。以TCA與TCA-D5的峰面積比為縱坐標(biāo)，TCA濃度為橫坐標(biāo)，所得線性關(guān)系方程為：y=0.0663x；線性決定系數(shù)R2：0.9999；線性濃度范圍：0.51～20.2 ng/L。

本研究對濃度為2.02 ng/L的標(biāo)液進(jìn)行了8次重復(fù)性試驗，檢測結(jié)果見表1。采用測定樣品加標(biāo)回收率來評價方法的準(zhǔn)確度，結(jié)果如表2所示。

綜上可以看出，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)為0.9999，重復(fù)性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%，加標(biāo)回收率在98.1%～101.3%，檢出限為0.51 ng/L，說明該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于檢測木塞中的TCA含量。

2.2 不同類別軟木塞中TCA遷移量分析

對2018年1月—2019年12月共計223批次軟木塞進(jìn)行了TCA檢測，不同類別軟木塞中TCA遷移量的整體情況如表3所示。檢出率最高的是1+1塞，達(dá)60%；其次是聚合塞；微顆粒塞和天然塞檢出率相對較低；而DIAM塞共檢測33批次，均未檢出TCA，這與DIAM塞的超臨界CO2萃取技術(shù)[12]密不可分，同時也說明木塞生產(chǎn)過程中TCA處理技術(shù)的重要性。

從TCA遷移量分布來看，不同類型的軟木塞差異較大，聚合塞中TCA遷移量范圍分布最寬，最高為5.76 ng/L，并且檢出的46批次中TCA遷移量的標(biāo)準(zhǔn)偏差也最大，說明聚合塞中TCA檢出值的離散程度最高；1+1塞雖檢出率最高，但TCA遷移量均在2.0 ng/L以下，檢出樣品的平均值為0.88 ng/L，遷移量范圍稍寬；天然塞和微顆粒塞檢出的TCA遷移量均在1.5 ng/L以下，范圍值較低。由此發(fā)現(xiàn)，聚合塞是造成葡萄酒TCA污染的最大風(fēng)險源。

將TCA遷移量最高的聚合塞按照不同范圍值進(jìn)行劃分，如表4所示。TCA范圍在1～2 ng/L的超過半數(shù)，占比54.3%，說明大部分的TCA遷移量分布在1～2 ng/L范圍內(nèi)；2～4 ng/L的占比接近20%；4 ng/L以上的占比為8.7%，而且平均值在5.1 ng/L。

對于軟木塞TCA遷移量的限量標(biāo)準(zhǔn)國家尚未有明確規(guī)定，本文按照公司內(nèi)控軟木塞入廠檢驗標(biāo)準(zhǔn)對TCA的限定要求（即天然塞、微顆粒塞≤1 ng/L，聚合塞、1+1塞（聚合塞棒體）≤ 2ng/L），對不同類別軟木塞的合格率進(jìn)行匯總，如圖2所示。1+1塞和DIAM塞合格率均為100%，天然塞和微顆粒塞合格率均在90%以上，而聚合塞的合格率最低，為87.76%。所以葡萄酒在軟木塞選用中對聚合塞應(yīng)慎重選擇。

圖1 TCA標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure1 The standard curve of TCA

表1 重復(fù)性試驗檢測結(jié)果Table 1 Results of repeated test

表2 加標(biāo)回收率試驗檢測結(jié)果Table 2 Results of recovery test

3 討論與結(jié)論

本文通過對2年內(nèi)收集的多批次不同類別軟木塞中TCA遷移量的檢測，初步認(rèn)為DIAM塞為TCA“零污染”，主要原因是DIAM塞經(jīng)過了“超臨界二氧化碳萃取”這一特殊的技術(shù)處理，徹底去除了由軟木塞帶來的TCA污染[12]，現(xiàn)在越來越多被葡萄酒廠家選用，以確保葡萄酒固有的香氣，讓釀酒師有一種“放心感”。

聚合塞檢出率高，合格率低，而且TCA檢出值范圍最寬，認(rèn)為聚合塞對葡萄酒的污染風(fēng)險程度最高。黨國芳等[18]對不同類型軟木塞裝瓶180 d和360 d后的樣品進(jìn)行品評，發(fā)現(xiàn)聚合塞封瓶的酒部分出現(xiàn)木塞味，在香氣方面表現(xiàn)明顯不如其它瓶塞（天然塞、1+1塞）封瓶的酒表現(xiàn)強(qiáng)烈；馮韶輝[19]在試驗中發(fā)現(xiàn)，浸泡聚合塞的酒液帶有比較濃的粉塵味道，類似米糠味，而浸泡天然塞和1＋1塞的酒液，除帶有輕微柔和的軟木味道外，沒有其他異味；李進(jìn)等[20]也在實驗品評中得出了類似的結(jié)論。聚合塞通常采用天然塞的邊腳料和粘合劑制作而成[17,21]，生產(chǎn)過程中部分TCA并不能被去除，而且聚合塞密封性也較差，用此封裝的葡萄酒貨架期較短，一般用于快速消費(fèi)的低端餐酒。隨著葡萄酒市場的成熟，目前該類軟木塞使用數(shù)量也逐漸減少，部分被微顆粒塞所替代。相比聚合塞，微顆粒塞顆粒更小，TCA去除相對徹底，彈性和密封性均比聚合塞好。本研究也發(fā)現(xiàn)微顆粒塞的TCA檢出率較低，而且遷移量絕大部分（91.67%）在1.0 ng/L以下的可控范圍內(nèi)。

圖2 不同種類軟木塞TCA遷移量合格率Figure 2 Qualification rate of TCA migration in different types of cork

表3 不同類別軟木塞中TCA檢出率、遷移量范圍和平均值Table 3 The detection rate,migration range and average value of TCA in different types of cork

表4 聚合塞中TCA遷移量不同范圍占比和平均值Table 4 The proportion and average of TCA migration in different ranges in synthetic corks

本研究也發(fā)現(xiàn)，天然塞和1+1塞的TCA雖有檢出，但整體上檢出率和遷移量比較低，只要葡萄酒廠家選用可靠的供應(yīng)廠商，并進(jìn)行嚴(yán)格的入廠檢驗，TCA污染風(fēng)險可控。另外，建議葡萄酒廠家可根據(jù)需要選用更高技術(shù)含量的產(chǎn)品，如目前很多軟木塞廠家生產(chǎn)的“單只檢驗”的天然塞，即通過人為感官或設(shè)備逐個塞子進(jìn)行TCA的檢測，保證每一只塞子的TCA遷移量均在1 ng/L以下，適用于高端葡萄酒產(chǎn)品。

雖然，軟木塞存在TCA污染的隱患，但仍然在葡萄酒使用中占據(jù)絕大部分的份額。據(jù)調(diào)查，天然軟木塞不僅是中國消費(fèi)者認(rèn)知度最高的瓶塞，并且是他們的首選，這就要求軟木塞生產(chǎn)廠家和葡萄酒生產(chǎn)廠家共同關(guān)注TCA污染的問題，保證消費(fèi)者買到放心的產(chǎn)品[22-23]。軟木塞的24 h浸泡試驗?zāi)転槎唐谄績Φ钠咸丫铺峁┦躎CA污染的危險指示，但是木塞本身有差異，而且封裝葡萄酒一段時間以后，TCA還可能從木塞基質(zhì)內(nèi)部向酒中進(jìn)一步遷移[24]，因此需要對封裝后葡萄酒中TCA遷移量進(jìn)一步跟蹤研究。