劉 佳，孫 元，任桂平，魯安懷，李 艷，丁●瑞

(造山帶與地殼演化教育部重點實驗室，礦物環(huán)境功能北京市重點實驗室，北京大學(xué) 地球與空間科學(xué)學(xué)院，北京 100871)

2019年魯安懷教授等首次提出“礦物膜”這一概念，揭示了地表廣泛分布的天然鐵錳氧化物等半導(dǎo)體礦物轉(zhuǎn)化太陽能的重要過程。直接暴露于太陽光下的巖石表面廣泛發(fā)育厚度約幾十納米到數(shù)百微米的鐵錳氧化物“礦物膜”，在日光作用下，“礦物膜”表現(xiàn)出良好的光催化性能，可參與并發(fā)生一系列氧化還原反應(yīng)(Luetal., 2019； 魯安懷等，2019)。這一發(fā)現(xiàn)引起學(xué)科領(lǐng)域?qū)Φ乇韽V泛分布的半導(dǎo)體礦物光催化作用的極大關(guān)注。同時，在自然界中存在可利用礦物光電子能量的非光合微生物，非光合微生物可利用半導(dǎo)體光電子實現(xiàn)對太陽光能的間接利用，為礦物半導(dǎo)體介導(dǎo)非光合微生物間接利用太陽光能提供了新途徑(Luetal., 2012； 魯安懷等，2013，2014)。

半導(dǎo)體礦物-微生物群落之間可發(fā)生電子傳遞過程(Renetal., 2018； Luetal., 2019)，陸地地表鐵錳氧化物“礦物膜”半導(dǎo)體特性與日光催化效應(yīng)，可直接影響該生境中微生物群落構(gòu)成、胞外電子傳遞效率及代謝活性(Renetal., 2019)。天然鐵錳氧化物能與氧氣共同作為微生物新陳代謝活動的終端電子受體，參與并有效促進微生物胞外電子傳遞(Renetal., 2017； 任桂平等，2017)。除了陸地之外，受太陽光影響的地球表面還有海洋透光層，較之地表土壤、戈壁等生境，水圈中微生物的種類及含量更為富集。

水圈是地球外圈層中作用最為活躍且連續(xù)不規(guī)則的圈層，包括海洋、湖沼、河流、冰川、地下水以及大氣層中的水分等(黃力等，2017)。水圈中存在地球上一半以上的微生物，包括細菌、真菌、藻類、病毒等，水圈微生物對地球元素循環(huán)(如碳、氮、硫元素)起到關(guān)鍵驅(qū)動作用(Bremner and Steele, 1978； Grossartetal., 2011； Prokopenkoetal., 2013)。海洋透光層一般認為是自然光穿過海水時達到光能衰減至1%的水層，其范圍為從頂部海水表面到底部光合輻射降至表面1%處(Kirk，1994)。海水透光層中存在大量懸浮顆粒物，如在西北太平洋中發(fā)現(xiàn)懸浮顆粒物主要由礦物顆粒、生物碎屑顆粒和膠態(tài)絮凝體組成，其中礦物顆粒主要為含氧鹽類礦物、氧化物和氫氧化物以及硫化物(胡文燁，2016)；在海水懸浮顆粒物中發(fā)現(xiàn)存在多種半導(dǎo)體礦物，其中在長江口及近海附近發(fā)現(xiàn)有鐵的氧化物及鐵的硫化物存在(范德江等，2014)。但是，目前對海洋透光層中懸浮顆粒物的半導(dǎo)體特性及礦物半導(dǎo)體與微生物間電子傳遞過程的研究少有報道，因此本研究將開展對日光參與下海洋透光層中礦物半導(dǎo)體與微生物間的交互作用及地球元素循環(huán)的調(diào)控機制等方面的探究。

主要對黃海透光層懸浮顆粒礦物組成進行分析表征，包括對礦物元素組成及礦物物相分析；通過16S rRNA測序?qū)Ｋ腹鈱游⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)進行分析，構(gòu)建雙室體系(丁竑瑞等，2012)，研究礦物-微生物間電子傳遞過程，結(jié)果表明海水環(huán)境中半導(dǎo)體礦物能夠有效參與并顯著促進微生物胞外電子傳遞，進一步豐富自然界中半導(dǎo)體礦物-微生物間電子傳遞機制與交互作用理論。

1 實驗材料和方法

1.1 樣品采集及處理

自黃海透光層采集天然海水樣品，海水樣品取樣點位于121°30′ E，34° 0′N水域，取樣點水深10 m。用真空泵抽濾海水礦物樣品至0.2 μm微孔濾膜上，經(jīng)超純水沖洗并烘干12 h得到礦物顆粒。

1.2 海水懸浮顆粒物礦物學(xué)表征

運用北京大學(xué)地球與空間科學(xué)學(xué)院電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS，Agilent 7500 Ce，USA)測試分析懸浮顆粒物的元素組成，測試方法為全譜測試，懸浮顆粒物溶樣采用酸溶法，樣品稀釋1 000倍。

采用北京大學(xué)物理學(xué)院場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM，Thermal Fisher Quattro S，USA)在二次電子像模式下觀察懸浮顆粒物的微觀形貌，并使用配有的EDX能譜儀對典型區(qū)域進行單點元素分析，測試采用低真空模式，工作電壓15.00 kV，真空壓強110 Pa。

使用北京大學(xué)分析測試中心X射線粉晶衍射儀(XRD，Rigaku Dmax-2400，JAPAN)對海水懸浮顆粒礦物物相進行測定分析，測試電壓40 kV，電流40 mA，X射線源為Cu靶的Kα1射線(λ=1. 540 6 ?)，步長0.02°，掃描速度4°/min，掃描范圍5°～90°。

利用北京大學(xué)地球與空間科學(xué)學(xué)院礦物環(huán)境功能北京重點實驗室激光共焦顯微拉曼光譜儀(Confocal Raman Microspectrometer，Renishaw inVia Reflex，UK)對懸浮顆粒礦物進行拉曼光譜測試，使用50 倍物鏡采集信號，激光波長為532 nm，激光強度10%，束斑直徑約1 μm，光柵2 400刻線，單次曝光2 s，累計5次，掃描范圍100～1 340 cm-1。

1.3 微生物群落結(jié)構(gòu)表征

實驗使用的微生物為天然海水原始微生物群落樣品，在121°30′ E，34° 0' N黃海海域、水深10 m處取3個樣品點A(34-10-01，代表34° 0′ N-10 m-01號取樣點)、B(34-10-02)、C(34-10-03)，針對微生物群落結(jié)構(gòu)，借助16S rRNA技術(shù)完成對海水樣品微生物群落測序分析，從門、綱、目、科、屬5個水平對海水中的原始微生物群落進行初步種群探究。

1.4 胞外電子實驗雙室體系構(gòu)建

利用電化學(xué)技術(shù)在雙室反應(yīng)裝置中測試微生物的胞外電子傳遞能力。采用“H”型雙室玻璃反應(yīng)體系對海水中微生物進行監(jiān)測及培養(yǎng)，每個室容量為135 mL，中間以直徑4 cm質(zhì)子交換膜(PEM，Du-pont，USA)分隔。質(zhì)子交換膜使用前依次經(jīng)過30% H2O2煮沸1 h、去離子水超聲清洗10 min、1 mol/L H2SO4浸泡1 h處理。陽極工作電極為梳狀石墨電極，陰極電極為板狀石墨電極，外尺寸均為7.5 cm×3.5 cm×0.5 cm(上海弘楓石墨制品有限公司)，石墨電極依次經(jīng)過1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH、去離子水浸泡1 h并超聲清洗；實驗裝置準備完畢后使用高壓蒸汽滅菌器，121℃滅菌20 min。

陽極接種本源海水微生物群落，所用富集培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，成分為： 10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl，稀釋10倍，調(diào)節(jié)pH值約為7.0；海水與培養(yǎng)基按照20∶1(體積比)接種富集培養(yǎng)兩周后用于后續(xù)實驗。

陰極海水懸浮顆粒礦物石墨電極制備方法：準確秤取0.08 g經(jīng)海水抽濾后的懸浮顆粒礦物，加入3 mL無水乙醇稀釋，超聲分散5 min，加入15 μL Nafion乳液再次超聲分散5 min混合均勻，玻璃棒均勻涂布于板狀石墨電極的兩面(有效面積7.5 cm×3.5 cm)，石墨電極使用前依次經(jīng)過經(jīng)1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH、去離子水浸泡1 h并超聲清洗，自然晾干12 h用于實驗。

1.5 電學(xué)參數(shù)測試及電化學(xué)技術(shù)表征

在超凈臺無菌條件下按10%接種量向LB培養(yǎng)基中接入海水富集液并注滿陽極室，使用硅膠封口；陰極室加入120 mL 0.1 mol/L KCl溶液，使用空氣泵持續(xù)低速鼓入空氣。實驗裝置置于生化培養(yǎng)箱(LRH-250)中，溫度控制35±1℃。

實驗裝置陽極與陰極間連接變阻箱作為外負載，使用數(shù)據(jù)記錄儀(ADC-16，Pico Technologies Limited，UK)實時監(jiān)測負載電壓，通過調(diào)節(jié)負載阻值獲得體系電流、電壓等相關(guān)電學(xué)參數(shù)，進而計算黃海透光層海水體系的極化曲線及功率密度曲線。實驗體系中陰陽兩極分別由UT 33B型數(shù)字萬有表測定相對于飽和甘汞電極的電壓，記錄兩極電勢。

2 結(jié)果與討論

2.1 海水懸浮顆粒物元素組成分析

ICP-MS測試結(jié)果顯示海水懸浮顆粒物的主要化學(xué)元素組成為Na(848×10-3)、K(187×10-3)、Ca(149×10-3)、Mg(38.9×10-3)、Al(37.7×10-3)等，同時含有較高含量的Mn(41.9×10-3)、Fe(31.1×10-3)、Ti(3.53×10-3)等元素。Mn、Fe、Ti金屬元素可能以富集金屬氧化物的形式存在于懸浮顆粒物中，為證實此推測對懸浮顆粒物樣品進行ESEM配以EDX能譜測試分析。

將干燥后的懸浮顆粒物進行環(huán)氧樹脂包埋制樣，用于環(huán)境掃描電子顯微鏡下懸浮顆粒物的微形貌觀察。ESEM二次電子像中懸浮顆粒物呈團絮狀，部分懸浮顆粒物外圍被有機質(zhì)包裹，典型的具有較規(guī)則幾何外形的礦物顆粒呈四方錐狀、薄板狀(圖1a)、厚板狀(圖1c)；配以EDX能譜數(shù)據(jù)顯示(圖1b、1d), 海水懸浮顆粒物中主要元素分別為O、Si、C、K、Al等，在部分具有較規(guī)則幾何外形的礦物中發(fā)現(xiàn)含量相對較高的Fe、Ti金屬元素，這些礦物的晶體形貌與針鐵礦、銳鈦礦、金紅石的晶形相吻合。為進一步確定懸浮顆粒物的主要礦物物相及富含F(xiàn)e、Ti元素的礦物物相，對其進行了XRD及顯微拉曼測試分析。

圖 1 ESEM下懸浮顆粒物的微形貌(a、c)及EDX能譜數(shù)據(jù)(b、d)Fig. 1 Morphology of suspended particulate under ESEM (a, c) and data of EDX (b, d)

2.2 海水懸浮顆粒物物相鑒定

顯微拉曼光譜測試明確發(fā)現(xiàn)懸浮顆粒礦物中含有銳鈦礦、金紅石、板鈦礦、針鐵礦等多種鐵、鈦半導(dǎo)體礦物(圖3)。銳鈦礦相中每個晶胞含有2個TiO2分子，拉曼活性光學(xué)模具有3個Eg振動模式(148、200、633 cm-1)、1個B1g(395 cm-1)和1個A1g(516 cm-1)振動模式(Ohsakaetal., 1978)。板鈦礦相TiO2屬于斜方晶系，每個晶胞中含有6個TiO2分子，板鈦礦相中154、220 cm-1分別為A1g、B1g振動模，329、395、475 cm-1為B2g振動模(Tompsettetal.,1995)。金紅石相TiO2屬于四方晶系，每個晶胞中含有2個TiO2分子，聲學(xué)模245 cm-1振動模式，中心對稱晶格振動模式為1個B1g(143 cm-1)、1個Eg(446 cm-1)、1個A1g(610 cm-1)和1個B2g拉曼活性振動模(Samara and Peercy, 1973)。針鐵礦為斜方晶系，其中265、272、384、463 cm-1分別為針鐵礦的特征峰(Thibeauetal., 1978； De Fariaetal., 1997)。前人已發(fā)現(xiàn)并報道銳鈦礦、金紅石、板鈦礦、針鐵礦等為半導(dǎo)體礦物(Bickleyetal., 1973； Andreozzietal., 2003； Kandieletal., 2010； Tsukamotoetal., 2012； Xieetal., 2013)。

圖 2 海水中懸浮顆粒物的XRD分析結(jié)果Fig. 2 XRD patterns of suspended particulate in marine

2.3 海水微生物群落結(jié)構(gòu)分析

針對3個取樣點A(34-10-01)、B(34-10-02)、 C(34-10-03)的微生物樣品，通過16S rRNA技術(shù)對海水樣品微生物群落進行測序，分析結(jié)果表明，門、屬水平相同深度的3個不同取樣點微生物種類差異不大，均顯示在門水平(圖4)主要含有變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、浮霉狀菌門Planctomycetes、酸桿菌門Acidobacteria、藍藻門Cyanobacteria、綠彎菌門Chloroflexi及芽單胞菌門Gemmatimonadetes等微生物，均為自然界常見的微生物門類，與丁斯予等(2019)、竇妍等(2015)在黃海水樣檢測的微生物菌群結(jié)果一致。根據(jù)菌群結(jié)構(gòu)分析，水樣中的優(yōu)勢菌群為變形菌門Proteobacteria，次優(yōu)勢菌群為放線菌門Actinobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、浮霉狀菌門Planctomycetes等。海洋擬桿菌門細菌與DNA轉(zhuǎn)化、脂類和蛋白質(zhì)等有機物質(zhì)的轉(zhuǎn)換相關(guān)，這些有機物質(zhì)的吸收與利用與水體環(huán)境中碳循環(huán)過程密切相關(guān)(Cottrell and Kirchman, 2000； O’Sullivanetal., 2002)。海洋浮霉狀菌門是海洋環(huán)境中重要微生物，對元素生物地球化學(xué)循環(huán)起著重要的作用(黃佩蓓等，2014)。

圖 3 海水中半導(dǎo)體礦物的拉曼光譜Fig. 3 Raman spectra of semiconductive minerals in marine

圖 4 門水平微生物群落結(jié)構(gòu)圖Fig. 4 Microbial species in phylum level

屬水平上3個取樣點中CandidatusActinomarina、Woeseia、Fluviicola、Lactobacillus菌屬均占較高比例(圖5)，水樣中優(yōu)勢菌屬為Woeseia、Fluviicola。Woeseia屬于革蘭氏陰性菌，兼性厭氧型，生長條件需要鹽類物質(zhì)(Poddaretal., 2014； Duetal., 2016)；Fluviicola為一種嚴格好氧菌，2000年被發(fā)現(xiàn)于英國加的夫塔夫河，此菌屬于革蘭氏陰性菌(O’Sullivanetal., 2005)。由于海洋中絕大多數(shù)微生物尚不能用現(xiàn)有的培養(yǎng)方法和技術(shù)進行分離培養(yǎng)(穆大帥等，2017)，因此樣品中絕大多數(shù)屬水平上的微生物仍為未知、未識別或未培養(yǎng)狀態(tài)。

2.4 礦物-微生物胞外電子轉(zhuǎn)移特性分析

實驗中構(gòu)建雙室體系(圖6)將礦物端員與微生物端員分隔開，進一步分析每個端員發(fā)生的氧化還原過程，進而明確海水中微生物端電子傳遞過程以及在礦物參與下微生物-礦物的交互作用。

圖 5 屬水平微生物群落結(jié)構(gòu)圖Fig. 5 Microbial species in genus level

圖 6 雙室實驗裝置示意圖Fig. 6 Schematic diagram of double-chamber experimental system 不同顏色圈點示意不同種類微生物； PEM—質(zhì)子交換膜； Data logger—負載電壓數(shù)據(jù)監(jiān)測； R—外接電阻 Little cycles with different colors represent different kinds of microorganisms; PEM—proton exchange membrane； Data logger—load voltage； R—external resistor

實驗裝置在生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15天后用于測試，根據(jù)體系實測的電流-電壓數(shù)據(jù)(Loganetal., 2006)繪制極化曲線與功率密度曲線(圖7)，經(jīng)擬合計算發(fā)現(xiàn)：陰極為石墨電極時，體系的開路電壓為330.80 mV(表1)，最大功率為8.376 9 mW/m2；陰極石墨板涂布海水透光層懸浮顆粒物后，反應(yīng)體系開路電壓顯著提升約100 mV，最大輸出功率比原體系有顯著提高，為原體系的1.44倍，但兩個體系內(nèi)阻變化較小，推測內(nèi)阻主要由裝置本身所決定，在反應(yīng)體系未調(diào)整情況下變化不顯著。當實驗體系為氧氣作為電子受體時，體系的極限電流為0.233 7 mA，加入懸浮顆粒礦物后體系的極限電流為0.296 2 mA，說明更多微生物胞外電子從陽極傳出，其代謝活動得以增強，實驗結(jié)果表明海水原位的微生物具有胞外電子傳遞能力。

圖 7 極化曲線與功率密度曲線Fig. 7 Polarization curves and power density curves

表1 反應(yīng)體系電子轉(zhuǎn)移過程電學(xué)參數(shù)Table 1 The electrical parameters of electron transfer in reaction systems

3 結(jié)論

以黃海海水透光層為研究對象，圍繞懸浮礦物組成及半導(dǎo)體礦物-微生物電子傳遞問題進行初步探究，借助現(xiàn)代礦物學(xué)測試技術(shù)分析海水透光層懸浮礦物成分，利用16S rRNA測序技術(shù)研究海水原位微生物群落結(jié)構(gòu)，構(gòu)建雙室海水懸浮礦物-微生物研究體系揭示海水透光層中半導(dǎo)體礦物能有效參與并顯著促進其原位微生物胞外電子傳遞，這一電子傳遞過程會伴隨并影響生物地球化學(xué)元素的循環(huán)過程。

(1) 黃海透光層中的懸浮顆粒物主要含有Si、O、Na、K、Ca、Al等元素，且含有較高含量的Mn、Fe、Ti等金屬元素；懸浮顆粒物的主要礦物物相為石英、鈉長石、方解石、云母和綠泥石等，且含銳鈦礦、金紅石、板鈦礦、針鐵礦等多種鐵、鈦半導(dǎo)體礦物。

(2) 黃海透光層的微生物群落在門水平上主要含有Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Planctomycetes、Acidobacteria、Cyanobacteria、Chloroflexi、Gemmatimonadetes等；屬水平上主要含有CandidatusActinomarina、Woeseia、Lactobacillus、Fluviicola等。其中海洋擬桿菌門Bacteroidetes與水體環(huán)境碳循環(huán)密切相關(guān)，海洋浮霉狀菌門Planctomycetes對元素生物地球化學(xué)循環(huán)起重要作用。

(3) 雙室電學(xué)體系研究表明，陰極礦物可以獲取來自陽極微生物傳出的電子，同時促進體系中電子流動并增強微生物的胞外電子還原作用。海水中的半導(dǎo)體礦物可與氧氣共同作為微生物新陳代謝活動過程中的電子終端受體，有利于提高微生物能量代謝效率并拓展其能量傳遞方式。