趙 強，李 惠，李文婕，馬 坤，趙陽安，趙金鳳

（天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741001）

苦蕎，又稱韃靼蕎麥（Fagopyrum Tataricum），為蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopymm Mill）雙子葉植物，是自然界中少有的藥食兩用農(nóng)作物。[1]我國苦蕎種植歷史悠久，是世界苦蕎種植的主產(chǎn)區(qū)。《詩經(jīng)》載“視爾如荍，貽我握椒”，荍即蕎麥，說明早在2700多年前，中國已經(jīng)開始種植蕎麥。南北朝時期的《齊民要術(shù)·大小麥第十》中對苦蕎播種量、播種期、產(chǎn)量水平、加工方式及食用方法等都有明確記載。[2-3]苦蕎性喜陰濕冷涼，多種植于高山地區(qū)，而甘肅獨特的地理自然環(huán)境更適于苦蕎生長，尤其慶陽、定西等地都是苦蕎的傳統(tǒng)種植區(qū)。[4]苦蕎富含蛋白質(zhì)（10%左右）、氨基酸（19種）等多種營養(yǎng)物質(zhì)，營養(yǎng)價值遠高于水稻、小麥和玉米等傳統(tǒng)糧食作物。[5]苦蕎中不僅含有多種維生素及鈣、銅、鋅等礦物質(zhì)微量元素，而且還富含黃酮類物質(zhì)（2%以上），具有顯著的“降三高”功效。[6]

脅迫是指一種顯著偏離于生物適宜生長范圍，可引發(fā)生物功能變化但不會立即使植物死亡的環(huán)境條件。[7]鹽脅迫是利用不同植物的生長特性，模擬土壤鹽類水平，改變種子萌發(fā)條件使植物對不同金屬鹽離子表現(xiàn)出不同的抗性反應(yīng)，從而使種子代謝速度和產(chǎn)物發(fā)生改變，促進種子萌發(fā)的一種方法。植物種子在萌發(fā)期和幼苗期的耐鹽性最差，其次是在生殖生長期，而在其他發(fā)育階段對鹽脅迫的敏感性也逐漸降低。[8]種子萌發(fā)對干旱和鹽分環(huán)境的響應(yīng)，反映了植物種子適應(yīng)逆境的生態(tài)機制。聚乙二醇PEG-6000是一種高分子滲壓劑，因本身不易自由通過植物細胞壁，不易滲入活細胞內(nèi)，不會給種子內(nèi)增加營養(yǎng)物質(zhì)，無毒，能使活細胞緩慢吸水等優(yōu)點，而常被作為模擬和研究植物干旱脅迫的最好材料。

為探究土壤鹽濃度對苦蕎種子萌發(fā)及其生長特性的影響，本研究以甘肅環(huán)縣苦蕎種子為試驗對象，研究PEG-6000、Na+、Mn2+、Cu2+共4種因素在不同濃度梯度下對苦蕎種子萌發(fā)的影響，測定其發(fā)芽勢、發(fā)芽率、芽長和含水量等指標，得出苦蕎種子在干旱脅迫和鹽脅迫條件下的耐受能力大小，并利用正交試驗法選出種子耐受性的上限值，根據(jù)上限值得到鹽脅迫對植物產(chǎn)生抑制作用的臨界點。通過研究干旱和鹽脅迫環(huán)境對苦蕎種子生長特性的影響，可提高耐鹽苦蕎品種的選育和種植水平，對今后我省苦蕎種植具有十分重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品

苦蕎種子（2017年11月12日，購于甘肅省慶陽市環(huán)縣洪德農(nóng)貿(mào)市場），選籽粒健碩飽滿、色澤正常、形狀均一，風(fēng)干保存。

1.1.2 儀器

DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州長城工貿(mào)有限公司），DT-1500A型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海恒科學(xué)儀器有限公司），MP-512型精密pH計（上海恒科學(xué)儀器有限公司），電子天平，直尺，燒杯，培養(yǎng)皿，容量瓶等。

1.1.3 試劑

聚乙二醇 PEG-6000、KMnO4、NaCl、MnSO4、CuSO4、三重蒸餾水等，其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

以三重蒸餾水為溶劑，分別配制1g·L-1的KM?nO4溶液，0、5%、10%、20%、25%的PEG-6000溶液，0、50、100、150、200mmoL · L-1的Na+溶液，0、5、10、15、20mmoL · L-1的Mn2+溶液，0、50、100、150、200mg · L-1的Cu2+溶液。

1.2.2 種子預(yù)處理

選取籽粒健碩飽滿、色澤正常、形狀均一，經(jīng)風(fēng)干保存的苦蕎種子，用1g·L-1的KMnO4溶液浸種10min消毒。[9]用三重蒸餾水緩水流多次沖洗至中性，并浸泡4～5h后，均勻擺放在鋪有四層紗布的培養(yǎng)皿中，于25℃恒溫箱中培養(yǎng)。

1.2.3 單因素試驗

PEG-6000脅迫處理。PEG-6000設(shè)置0、5%、10%、20%、25%共5組不同濃度梯度，向每組放置苦蕎種子的培養(yǎng)皿中加入20mL處理液后在25℃培養(yǎng)。[10]苦蕎種子發(fā)芽時間為3～7d，此時種子的萌發(fā)情況基本穩(wěn)定，發(fā)芽試驗結(jié)束后統(tǒng)計種子萌發(fā)和幼苗生長情況，計算其發(fā)芽率、發(fā)芽勢、芽長及含水量等指標。[11]

Na+脅迫處理。Na+設(shè)置 0、50、100、150 和200mmoL·L-1共5組不同濃度梯度，方法同上。

Mn2+脅迫處理。Mn2+設(shè)置 0、5、10、15、20mmoL·L-1共5組不同濃度梯度，方法同上。

Cu2+脅迫處理。Cu2+設(shè)置 0、50、100、150、200mg·L-1共5組不同濃度梯度，方法同上。

1.2.4 正交設(shè)計試驗

選取單因素試驗中的4個主要影響因素，各因素下設(shè)置5個水平，另置空白試驗，建立6因素5水平的L25(56)正交試驗表。[12]

1.2.5 苦蕎種子生長特性指標的測定

苦蕎種子發(fā)芽勢的測定。發(fā)芽勢是植物種子萌發(fā)過程中的一個重要指標，其代表種子萌發(fā)所需的時間長短，以胚根突破種皮達到種子長度的一半作為種子的發(fā)芽標準。[13]將消毒后的苦蕎種子浸于三重蒸餾水中4～5h，取浸種后苦蕎種子置于鋪有四層紗布的培養(yǎng)皿中，25℃培養(yǎng)，第4d測定發(fā)芽勢。計算公式如下：

苦蕎種子發(fā)芽率的測定。種子的發(fā)芽率代表了種子成活率的高低，以7d作為苦蕎種子萌發(fā)的一個周期，在第7d結(jié)束時按照以下公式計算其發(fā)芽率。

苦蕎種子芽長的測定。經(jīng)過各溶液浸泡后的苦蕎種子，測定其芽長（以胚根突破種皮達到種子長度的一半作為種子的發(fā)芽標準）。[13]

苦蕎種子含水量的測定。以培養(yǎng)后的1～7d作為苦蕎種子萌發(fā)的一個周期，第7d結(jié)束培養(yǎng)，用濾紙吸干種子表面多余水分，稱其總鮮重，置于60℃烘箱中烘干，24h后稱重，濕重減去干重得出種子的含水量。[14]

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

以SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件，對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 PEG-6000脅迫處理

苦蕎種子在第2d開始萌發(fā)，第6d長勢最好，但培養(yǎng)至第7d后，種子根部開始出現(xiàn)衰亡，說明苦蕎種子萌發(fā)的一個周期已結(jié)束。當PEG-6000濃度為5%時，苦蕎種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率達到峰值，分別為53.33%和76.67%，可初步認為此濃度下最有利于種子萌發(fā)。隨著PEG-6000濃度的增加，其對苦蕎種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的抑制作用均增強，芽長變短，含水量降低。當PEG-6000濃度為20%時，苦蕎種子的發(fā)芽勢與發(fā)芽率顯著下降（P＜0.05）。當PEG-6000濃度大于20%時，苦蕎種子萌發(fā)受到明顯抑制。當PEG-6000濃度達到25%時，芽長達到最低值，苦蕎種子受到高濃度PEG-6000的脅迫作用，含水量雖為0.093%，但由于破壞了種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其發(fā)芽率為零，見圖1。

2.1.2 Na+脅迫處理

苦蕎種子在第2d開始萌發(fā)，第4d長勢最好，培養(yǎng)到第5d時，種子根部開始出現(xiàn)衰亡。當濃度為50mmoL·L-1Na+溶液處理時，苦蕎種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率與對照相比，增長了10%和6.777%，當Na+濃度逐漸升高時，對苦蕎種子的脅迫作用增強，其發(fā)芽勢與發(fā)芽率逐漸降低，直至Na+濃度達到200mmoL·L-1時，破壞了種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其死亡，見圖2。

圖1 PEG-6000對苦蕎種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、芽長及含水量的影響

圖2 Na+對苦蕎種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、芽長及含水量的影響

2.1.3 Mn2+脅迫處理

苦蕎種子在第2d開始萌發(fā)，第6d長勢最好，但是培養(yǎng)到第7d時，種子根部開始出現(xiàn)衰亡，說明苦蕎種子萌發(fā)的一個周期已結(jié)束。當在濃度為5和10 mmoL·L-1的Mn2+溶液作用下，苦蕎種子的發(fā)芽勢均為46.67%，其發(fā)芽率、芽長和含水量大致相同且均低于對照組，說明在兩個不同濃度處理液中，苦蕎種子萌發(fā)狀況基本相同。隨著Mn2+濃度的不斷增加，其發(fā)芽勢、發(fā)芽率、芽長和含水量均受到不同程度的抑制而逐減降低，尤其在20mmoL·L-1處理下各指標顯著降低，發(fā)芽勢較對照組下降了46.777%，發(fā)芽率下降了60%，芽長降3mm，嚴重抑制了苦蕎萌發(fā)和胚芽生長。因此使用5mmoL·L-1的Mn2+溶液浸種效果最好，可最大程度促進苦蕎種子萌發(fā)和幼苗生長，見圖3。

2.1.4 Cu2+脅迫處理

苦蕎種子在第2d開始萌發(fā)，第5d長勢最好，培養(yǎng)到第6d時，種子根部開始出現(xiàn)衰亡。當Cu2+濃度為50mg·L-1時，苦蕎種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率較對照組分別增加了16.667%和3.334%，當Cu2+濃度高于50mg·L-1時，其發(fā)芽勢等值均低于對照組，說明50mg·L-1的Cu2+濃度浸種效果最優(yōu)。經(jīng)Cu2+脅迫的苦蕎芽長較對照組持續(xù)減少，說明高濃度Cu2+對其芽長有明顯的抑制作用，見圖4。

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

2.2.1 正交試驗設(shè)計

選取PEG-6000濃度A（%）、Na+濃度B（mmoL ·L-1）、Mn2+濃度C（mmoL ·L-1）、Cu2+濃度D（mg·L-1）4個因素，設(shè)置5個水平，另置空白組，進行L25(56)正交試驗，以苦蕎種子發(fā)芽率（%）為評價指標。結(jié)果見表1、2所示。由表1、2可知，根據(jù)分析可知，A2B4C5D1，即在PEG-6000濃度5%、Na+濃度150mmoL · L-1、Mn2+濃度20mmoL · L-1、Cu2+濃度0mg· L-1條件下，4種因素對苦蕎種子發(fā)芽脅迫影響最低，此時苦蕎種子的發(fā)芽率為76.67%。其余各組均對苦蕎種子發(fā)芽脅迫有一定影響，當組合為A4B2C5D3和A5B1C5D4時，苦蕎種子的發(fā)芽率降低至為13.33%，說明各種鹽濃度增加對發(fā)芽率有一定的影響。

表1 正交試驗因素水平設(shè)計

表2 正交試驗測定結(jié)果

圖3 Mn2+對苦蕎種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、芽長及含水量的影響

圖4 Cu2+對苦蕎種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、芽長及含水量的影響

2.2.2 極差分析

用極差分析法可較為直觀地分析出試驗中的主次因素，并且通過簡單的對比得出最優(yōu)水平的一組數(shù)據(jù)。[15]極差R值的大小表示不同的水平對種子萌發(fā)結(jié)果的影響程度，極差R值越大，表示該因素下不同水平之間影響也越大，反之，則越小。由正交試驗測定數(shù)據(jù)分析得出：RD＞RA＞RB＞RC，因此D因素（Cu2+濃度）是影響苦蕎種子發(fā)芽的主要脅迫因素，A因素（PEG-6000濃度）為次要脅迫因素。

2.2.3 方差分析

方差分析是分類變量與定距變量之間的相關(guān)性分析。通過SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件，分析各因素引起的數(shù)據(jù)波動和誤差引起數(shù)據(jù)波動，比較其差異程度，檢驗兩個或兩個以上的變量總體均值是否相等來判斷分類型自變量對數(shù)值型因變量是否有顯著型差異，從而推斷相應(yīng)因素不同水平總體均值差異的顯著性。[15]

經(jīng)計算，K=876.67，C=K2/n=30742.01（C稱為標準數(shù)），計算總離差平方（ST）與誤差平方和（SE）。

對25組試驗的發(fā)芽率用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行顯著性分析，得出每組試驗下發(fā)芽率的平方和、自由度、均方和以及檢驗顯著性的F值。由表3 可知，F(xiàn)D=4.3518＞F(4,8)0.025=4.05，F(xiàn)D=4.3518＞F(4,8)0.05=3.84，F(xiàn)D=4.3518＞F(4,8)0.10=2.81，D因素對試驗結(jié)果的影響表現(xiàn)為不僅在0.025水平，0.05水平或0.1水平均表現(xiàn)出顯著，因此D因素是顯著型因素。A因素僅次于D因素，為次要影響因素。而B因素不僅在0.025不顯著，0.1上也表現(xiàn)為不顯著，所以可認為B因素對試驗結(jié)果的影響較小，相比之下C因素影響效果最不明顯。

表3 方差分析表

根據(jù)每組試驗條件對苦蕎種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、根長以及含水量的影響，考慮到各因素間的交互作用以及成本因素等，最終確定A2（PEG-6000濃度為5%）、B4（Na+濃度為150mmoL · L-1）、C2（Mn2+濃度為5mmoL · L-1）、D2（Cu2+濃度為50mg· L-1）為苦蕎生長的臨界值。當增加上述四個因素濃度時，苦蕎種子萌發(fā)開始受到抑制，且抑制作用隨著離子濃度的升高而逐漸增強。

3 結(jié)論

近年來，由于人為因素導(dǎo)致的土壤鹽堿化問題日益嚴重，不僅造成了環(huán)境污染，而且也導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)甚至死亡。因此有必要對農(nóng)業(yè)土壤進行監(jiān)測，得出土壤中水、鹽離子含量，根據(jù)各因素上限值獲得其對植物種子產(chǎn)生抑制作用的臨界點，并將該成果應(yīng)用于現(xiàn)實生產(chǎn)生活中，合理指導(dǎo)農(nóng)作物的培育種植，提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)值，改善農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境和保護土壤環(huán)境。

本試驗對苦蕎種子萌發(fā)及生長特性進行研究，采用正交法進行試驗設(shè)計，其方法簡便，能夠合理得出各因素中最有利于苦蕎種子萌發(fā)的一組濃度和種子耐受性的上限值，根據(jù)方差分析和統(tǒng)計學(xué)軟件處理，選擇PEG-6000濃度為5%、Na+濃度150mmoL ·L-1，Mn2+濃度5mmoL · L-1和Cu2+濃度50mg·L-1時，苦蕎種子萌發(fā)受到抑制，且抑制作用隨著離子濃度的升高而呈逐漸增強趨勢。通過試驗研究，可避免由于高濃度溶液破壞苦蕎種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致種子死亡，進而降低苦蕎產(chǎn)值，為選擇適宜苦蕎種植的土壤外部環(huán)境提供了一定的理論參考。