柴金龍，胡晟源，陳麗，王淑軍，焦豫良，楊杰，劉姝，*，房耀維

（1.江蘇海洋大學(xué)海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港222005；2.江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院，江蘇連云港222005；3.江蘇海洋大學(xué)海洋資源與環(huán)境學(xué)院，江蘇連云港222005）

蛋白酶是一類水解蛋白質(zhì)肽鍵并將其分解為蛋白胨、多肽、游離氨基酸的一類酶的總稱[2]。蛋白酶具有催化活性高、條件溫和、專一性強(qiáng)、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)加工、洗滌劑添加、制藥、污水處理等多種工業(yè)領(lǐng)域[2-5]。更值得關(guān)注的是蛋白酶在有機(jī)溶劑介質(zhì)中可以催化廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥的短肽的合成[6]。但是，有機(jī)溶劑對(duì)大多數(shù)天然蛋白酶具有毒性，極大地限制了其在有機(jī)合成領(lǐng)域的應(yīng)用。通過(guò)生物催化工程[7-9]和溶劑工程[10-11]可提高酶類有機(jī)溶劑耐受性，但這些方法操作復(fù)雜且成本極高。獲得天然耐受有機(jī)溶劑的蛋白酶可節(jié)約成本、提高效率[12]。另外，已報(bào)道的耐有機(jī)溶劑蛋白酶種類有限，難以滿足工業(yè)催化需要。明確蛋白酶耐受有機(jī)溶劑的分子機(jī)制，通過(guò)理性設(shè)計(jì)提高蛋白酶有機(jī)溶劑耐受性提供了解決該問(wèn)題的有效途徑。

目前，蛋白酶有機(jī)溶劑耐受性的分子機(jī)制尚不完善。通過(guò)酶基因的異源表達(dá)利于酶的純化，也為酶的理性設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)。Rahman等[13]從P.aeruginosa strainK中克隆得到一段由479個(gè)氨基酸耐有機(jī)溶劑堿性蛋白酶的序列。該酶在E.coli BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)。承龍飛等[14]從Bacillus cereus WQ-2中克隆獲得了566個(gè)氨基酸的耐有機(jī)溶劑中性蛋白酶序列，并將其在枯草芽孢桿菌WB600中表達(dá)，重組菌的蛋白酶活力比野生菌提高了約4倍，達(dá)到17 400 U/mL。何小丹等[15]從B.licheniformis YP1A中克隆得到了一段1 264 bp的耐有機(jī)溶劑蛋白酶基因，用兩種不同啟動(dòng)子的載體將其在枯草芽孢桿菌WB800中表達(dá)，最后得到的重組菌的發(fā)酵產(chǎn)酶水平達(dá)到395 U/mL。

本研究組前期篩選的菌株Bacillus sphaericus DS11分泌耐有機(jī)溶劑蛋白酶，將其在25%的正己醇、苯、二甲苯等有機(jī)溶劑中孵育14 d后仍然保持80%以上的蛋白酶活力[16-17]。擴(kuò)增該蛋白酶基因序列，BLAST發(fā)現(xiàn)該序列同B.sphaericus 2297蛋白酶基因（GenBank登錄號(hào)：AJ238598.1）的氨基酸序列與其相似度達(dá)到88%。本研究全構(gòu)建了重組枯草芽孢桿菌B.subtilis WB800-pMA0911-sph，實(shí)現(xiàn)蛋白酶卵巢特異性啟動(dòng)子（ovarian-specific promoter，OSP）的胞外表達(dá)，并研究了重組酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)和其對(duì)有機(jī)溶劑的耐受特性，為以后進(jìn)一步探索B.sphaericus DS11蛋白酶有機(jī)溶劑耐受性分子機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞、B.subtilis WB800感受態(tài)細(xì)胞：杭州寶賽生物科技有限公司；大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pMA0911-H3：江南大學(xué)；環(huán)己烷、正丁醇、二甲苯：阿拉丁試劑有限公司；DNA Marker、T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶 BamH I、ECOR I、質(zhì)粒小抽試劑盒、Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR、鎳離子金屬親和層析柱：寶生物工程有限公司（TaKaRa）。試驗(yàn)所用試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

Q5000微量核酸蛋白檢測(cè)儀：美國(guó)Quawell公司；T100TMThermal Cycler PCR儀、Sub-Cell GT1704481凝膠電泳槽、Gel DocTMEZ凝膠成像儀：美國(guó)Bio-RAD公司；Thermo多功能酶標(biāo)儀：南京寶誠(chéng)生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基（L）：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g。

LB奶粉固體培養(yǎng)基（L）：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，奶粉 5 g，瓊脂 20 g。

脫脂奶粉等培養(yǎng)基其余成分121℃，20 min滅菌后，直接加入未凝固的培養(yǎng)基中，搖勻后倒平板（注意不要產(chǎn)生氣泡和塊狀沉淀）。

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

設(shè)計(jì)擴(kuò)增osp上下游引物，分別在上下游引物添加BamH I、ECOR I酶切位點(diǎn)，在下游引物添加His標(biāo)簽。

PpMa09-F1 CCGGAATCCATGGATAGCGAAGATAGCTTAGG 和 PpMa09-R1 CGCGGATCCTAATGATGATGATGATGATGTTGAACACGAGCGAAG，由南京思普金生物科技公司合成。

1.3.3 重組表達(dá)菌株的構(gòu)建

將斜面4℃保藏的B.sphaericus DS11在LB固體平板三區(qū)劃線，37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)。在1.5 mL EP管中加入 50 μL Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR，挑取單菌落加入EP管中，80℃水浴15 min，4 000 r/min離心后上清液作為模板，添加引物擴(kuò)增蛋白酶基因osp。將osp和載體質(zhì)粒pMA0911-H3分別用ECOR I、BamH I兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的基因sph片段和載體質(zhì)粒，T4 DNA連接酶16℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化到克隆載體E.coil DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于Amp抗性（100 μg/mL）的 LB平板，37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落轉(zhuǎn)接到含有Amp抗性（100 μg/mL）液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min搖床培養(yǎng)后抽提質(zhì)進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。利用質(zhì)粒提取試劑盒提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMA0911-sph，然后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)B.subtilis WB800，涂布于卡那抗性（50 μg/mL）的 LB奶粉平板上，37℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)。挑取周?chē)忻黠@透明圈的轉(zhuǎn)化子單菌落進(jìn)行菌落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）驗(yàn)證并進(jìn)行基因測(cè)序。

1.3.4 osp的表達(dá)、純化及電泳分析

將重組菌和含有空質(zhì)粒pMA0911的WB800菌株分別挑取單菌落接入到含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，180 r/min、37℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。將菌液于4℃下，8 000 r/min離心30 min，得到的上清液即為粗酶液。利用鎳柱根據(jù)說(shuō)明書(shū)方法對(duì)粗酶液進(jìn)行純化，并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)[18]。

1.3.5 蛋白酶活性測(cè)定

利用福林酚法測(cè)定蛋白酶活力[19]。在試管中加入的1 mL的酶液、1 mL 2%pH 8.0的酪蛋白底物（需要在40℃先預(yù)熱），于40℃水浴鍋中水浴反應(yīng)10 min，加入2 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），充分振蕩混勻，靜置10 min（終止反應(yīng)）后，用濾膜過(guò)濾，取1 mL濾液，加入5 mL 0.4 mol/L的碳酸鈉溶液和1 mL的福林酚試劑搖勻后，置于40℃水浴鍋中顯色20 min，測(cè)定上清液的吸光度（A680）。酶活測(cè)定時(shí)需要設(shè)置一個(gè)對(duì)照組，對(duì)照組需要直接先在酶液中加入TCA，反應(yīng)10 min后，再加入底物靜止10 min后過(guò)濾后取1 mL濾液，后續(xù)操作同試驗(yàn)組。酶活單位（U/mL）：在40℃條件下，每分鐘水解酪蛋白底物產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位。

1.3.6 重組OSP酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.6.1 溫度對(duì)重組OSP酶活性和穩(wěn)定性的影響

用2%pH 8.0的酪蛋白溶液作為底物，與酶液混勻后，置于 20、30、40、50、60、70 ℃下水解反應(yīng) 10 min，TCA終止反應(yīng)，測(cè)定酶活力。將酶液分別在20、30、40、50、60 ℃下保溫 2、4、6、7、10 h后，測(cè)定其剩余酶活力。

1.3.6.2 pH值對(duì)重組OSP酶活性和穩(wěn)定性的影響

以2%的酪蛋白為底物，分別在pH 5.0～6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、pH 6.0～8.0的磷酸鹽緩沖液、pH 8.0～9.0的Tris-HCl緩沖液、pH 9.0～10.0的甘氨酸-NaOH緩沖液中，在最適溫度下水解反應(yīng)10 min，測(cè)定酶活力。將酶液于pH 5.0～10.0的不同緩沖體系中孵育24 h后，測(cè)定其剩余酶活力。

1.3.6.3 金屬離子對(duì)重組蛋白酶活力的影響

乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）終濃度為1 mmol/L，各種金屬離子溶液與酶液混至終濃度分別為1 mmol/L和2.5 mmol/L，并且設(shè)置對(duì)照組不添加金屬離子，在最適條件和pH值條件下反應(yīng)10 min后測(cè)定剩余酶活力。

1.3.6.4 重組OSP的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性

將酶液與終濃度為25%正丁醇、環(huán)己烷、二甲苯、乙醇混勻，30 ℃、180 r/min 分別孵育 30 min、1、2、24 h、6 d，按最適反應(yīng)條件測(cè)定剩余酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)菌株的構(gòu)建和驗(yàn)證

將蛋白酶基因sph連接到載體pMA0911-H3，得到重組質(zhì)粒pMA0911-osp。將重組質(zhì)粒pMA0911-osp轉(zhuǎn)化E.coil DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，搖菌后用質(zhì)粒小抽試劑盒抽提質(zhì)粒并雙酶切驗(yàn)證，重組質(zhì)粒pMA0911-osp雙酶切結(jié)果見(jiàn)圖1。

將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒pMA0911-osp轉(zhuǎn)化B.subtilis WB800感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后涂布于卡那抗性（50 μg/mL）LB奶粉平板。挑取有透明圈的單菌落PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，重組枯草芽孢桿菌B.subtilis WB800-pMA0911-osp菌落PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。進(jìn)一步序列測(cè)定表明序列準(zhǔn)確，表明重組枯草芽孢桿菌工程菌B.subtilis WB800-pMA0911-osp構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒pMA0911-osp雙酶切結(jié)果Fig.1 Recombinant plasmid pMA0911-osp Double digestion results

圖2 重組枯草芽孢桿菌B.subtilis WB800-pMA0911-osp菌落PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Results of PCR identification of recombinant B.subtilis WB800-pMA0911-osp colonies

2.2 SDS-PAGE分析

將B.subtilis WB800-pMA0911-osp發(fā)酵粗酶液用鎳柱進(jìn)行蛋白純化，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，重組菌B.subtilis WB800-pMA0911-His6-osp發(fā)酵上清SDS-PAGE電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。表達(dá)的蛋白酶大小約為33 kDa。

2.3 重組OSP酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 重組蛋白酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性

溫度對(duì)蛋白酶活力的影響見(jiàn)圖4，溫度對(duì)蛋白酶穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖5。

圖3 重組菌B.subtilis WB800-pMA0911-His6-osp發(fā)酵上清SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant B.subtilis WB800-pMA0911-sph fermentation supernatant

圖4 溫度對(duì)蛋白酶活力的影響Fig.4 Effects of temperature on protease activity

圖5 溫度對(duì)蛋白酶穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of temperature on protease stability

重組OSP的最適反應(yīng)溫度為40℃，在20℃～40℃范圍內(nèi)，蛋白酶OSP的活性隨溫度的升高而上升，40℃時(shí)，酶活力達(dá)到最高，當(dāng)溫度從40℃升高到70℃時(shí)，酶活力逐漸降低，70℃時(shí)，酶活下降約70%。蛋白酶OSP在低溫條件下（20℃～30℃）有較好的穩(wěn)定性，可以保持較高的酶活性。溫度高于30℃后，酶穩(wěn)定性迅速下降，當(dāng)保溫溫度為60℃時(shí)，僅2h，酶活下降約70%。

2.3.2 重組蛋白酶的最適pH值及pH值穩(wěn)定性

pH值對(duì)蛋白酶活力的影響見(jiàn)圖6，pH值對(duì)蛋白酶穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖7。

圖6 pH值對(duì)蛋白酶活力的影響Fig.6 Effects of pH value on protease activity

圖7 pH值對(duì)蛋白酶穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of pH value on protease stability

由圖6可知，重組蛋白酶OSP的最適反應(yīng)pH值為8.0。pH值為5.0～8.0時(shí)，蛋白酶OSP的酶活隨著pH值的升高而增加，pH值為8.0時(shí)，酶活力達(dá)到最高；當(dāng)pH值從8.0升到10.0時(shí)，酶活力逐漸下降；且由圖6可知，酸性條件下，酶活下降較快，而pH值為10.0時(shí)，仍能保持75%左右的酶活，說(shuō)明蛋白酶OSP為弱堿性蛋白酶。

由圖7可知，當(dāng)重組酶在其最適反應(yīng)pH值的緩沖液中有較高的穩(wěn)定性，用pH8.0的緩沖液處理酶液24h，仍能保持98%左右的酶活。用pH 5.0的緩沖液處理酶液24 h后，蛋白酶活性下降超過(guò)90%，而堿性條件對(duì)酶活影響相對(duì)較弱，用pH 10.0的緩沖液處理酶液24 h后，剩余蛋白酶活力約為30%左右。

2.3.3 金屬離子對(duì)重組蛋白酶活力的影響

金屬離子重組蛋白酶OSP的酶活力影響如圖8所示。

Sr2＋、K＋、Mg2＋對(duì)酶活有促進(jìn)作用，其中 K＋的促進(jìn)作用最強(qiáng)，能使酶活提高約1.5倍；低濃度的Co2＋對(duì)酶活有促經(jīng)作用，而高濃度的Co2＋則會(huì)抑制蛋白酶活性；Fe3＋、Ba2＋、Ca2＋對(duì)酶活有抑制作用；Cd2＋、Na＋對(duì)蛋白酶酶活影響很小。Gupta等[20]報(bào)道Ca2＋對(duì)Pseudomonasaeruginosa PseA所產(chǎn)的耐有機(jī)溶劑蛋白酶有抑制作用，試驗(yàn)結(jié)果與本研究結(jié)果一致；Sasithorn Uttatree等[21]篩選出一株耐有機(jī)溶劑蛋白酶的菌株Bacillus megaterium，試驗(yàn)結(jié)果顯示Mg2＋對(duì)酶活有促進(jìn)作用，而本研究結(jié)果表明Mg2＋對(duì)蛋白酶OSP酶活同樣顯示出促進(jìn)作用。

2.3.4 重組OSP有機(jī)溶劑穩(wěn)定性

用log POW值不同的4種有機(jī)溶劑處理蛋白酶OSP后，酶活力剩余情況如表1所示。

表1 有機(jī)溶劑對(duì)蛋白酶活力的影響Table 1 Effects of different organic solvents on protease activity

由表中可以看出蛋白酶OSP在不同極性常數(shù)的 有機(jī)溶劑中，耐受性差異很大。其在log POW值為0.8～3.1的3種有機(jī)溶劑中孵育6 d后，仍能保持53%以上的酶活性，但log POW值小于0.8后，酶活下降較快，其在log POW值為-0.24的乙醇溶液中孵育6 d后，酶活下降約70%。且有機(jī)溶劑孵育時(shí)間不同，對(duì)酶活性的影響也很大。當(dāng)孵育時(shí)間為30 min時(shí)，4種有機(jī)溶劑孵育的蛋白酶剩余酶活力均顯著性差異；當(dāng)孵育時(shí)間為1 h～2 h時(shí)，用環(huán)己烷和正丁醇孵育的兩組蛋白酶的剩余酶活力無(wú)顯著性差異，但其結(jié)果與另外兩組的結(jié)果存在顯著性差異；當(dāng)孵育時(shí)間為24 h～6 d時(shí)，4種有機(jī)溶劑孵育的蛋白酶剩余酶活力均有顯著性差異。Divakar等[22]研究發(fā)現(xiàn)，菌株Aeromonas veronii PG01所產(chǎn)的耐有機(jī)溶劑蛋白酶用極性常數(shù)較小的乙醇中（log POW-0.24）孵育5 h后，剩余酶活力僅剩25.3%左右，而蛋白酶OSP用乙醇孵育6 d后，剩余酶活力仍能達(dá)到33%，說(shuō)明蛋白酶OSP對(duì)親水性有機(jī)溶劑有著更好的耐受性。

3 結(jié)論

將源于B.sphaericus DS11蛋白酶osp在B.subtilis WB800中胞外分泌表達(dá)，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)和有機(jī)溶劑耐受特性進(jìn)行研究。重組酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，最適反應(yīng)pH值為8.0，且其在中低溫（20℃～30℃）、弱堿性（pH 7.0～9.0）。蛋白酶OSP為耐有機(jī)溶劑蛋白酶，且其對(duì)log POW值在0.8～3.1范圍的有機(jī)溶劑有較好的耐受性。