俞麗燕

（福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350108）

藻藍蛋白(Phycocyanin， PC)是一種重要的藻膽蛋白，具有吸收和傳遞光能的性質，呈亮藍色，屬于胞內蛋白，易溶于水，具有抗腫瘤、增強免疫力、抗炎等功能[1]。在食品工業(yè)可作為天然著色劑和營養(yǎng)保健品開發(fā)；在化妝品行業(yè)作為添加劑開發(fā)；在制藥工業(yè)也具有巨大潛力待挖掘開發(fā)[2]。隨著科學技術的進步，藻藍蛋白分離純化技術不斷更新迭代，其產品質量和經(jīng)濟性提升迅速，使開發(fā)應用領域漸受各方產業(yè)和學者關注。為此，本文將綜述微藻藻藍蛋白的分子結構與生物學功能以及提取分離純化工藝的最新進展，以期為加快藻藍蛋白在食品、保健品、化妝品、制藥等領域產業(yè)化進程提供依據(jù)。

1 微藻藻藍蛋白的分子結構與生物學功能

1.1 微藻藻藍蛋白的分子結構

藻膽體（Phycobilisome， PBS）存在于微藻細胞內，是重要的光收集復合體（Light harvesting complex，LHC），主要吸收黃綠光區(qū)的光源，由多種不同顏色水溶藻膽蛋白（85%～90%）和連接多肽（15%～10%）鏈接而成，主要分為2部分：核心復合物位于中心，棒狀復合物則在中心周圍[3]。藻膽體（PBS）是由不同的藻膽蛋白（Phycobiliproteins， PBP）按特定的排列順序組裝而成，吸收的光能依次通過藻紅蛋白（Phycoerythrin， PE）、藻藍蛋白（Phycocyanin，PC）和別藻藍蛋白（Allophycocyanin， APC）傳遞，最后傳遞到反應中心光系統(tǒng)I（光系統(tǒng)I， PS I）和II（光系統(tǒng)II， PS II）（圖1[4]）。

圖1 微藻藻膽體（PBS）結構和生物功能模型[4]

C-藻藍蛋白（C-Phycocyanin， C-PC）來源于藍藻，R-藻藍蛋白（R-Phycocyanin， R-PC）來源于紅藻以及R-藻藍蛋白2（R-Phycocyanin II， R-PC 2）來源于聚球藻是藻藍蛋白（PC）的主要類型[5]。α-亞基，含兩個半胱氨酸和兩個甲硫氨酸殘基，分子量約為12～19 kDa；β-亞基，含三個半胱氨酸和五個甲硫氨酸殘基，分子量約為14～21 kDa，是構成藻藍蛋白（PC）的兩種基本單元，每種亞基含有160～180個氨基酸序列[6，7]。αβ單體（圖2a[8]）是由α，β兩個亞基自行組裝形成，α3β3環(huán)狀三聚體（由αβ單體組裝形成）（圖2b[8]）和α6β6六聚體（兩個α3β3三聚體堆積而成）（圖2c[8]）是藻藍蛋白的存在主要形式，直徑約11 nm[8]。藻藍蛋白的發(fā)色團是藻藍素（圖3[4]）—一種線性四吡咯化合物，通過硫醚鍵與載體蛋白連接[9]。

圖2 PC的組成單位及基本結構[8]

圖3 藻藍素的分子結構式[4]

1.2 微藻藻藍蛋白的生物學功能

藻藍蛋白具有抗氧化活性，有研究表明，藻藍蛋白能夠調節(jié)由自由基的清除和產生引起的代謝紊亂，而自由基是許多疾病的發(fā)生有直接或間接的聯(lián)系。藻藍蛋白的抗氧化活性與抗炎、保護肝臟、清除白內障、保護血管、神經(jīng)保護以及預防腫瘤等有關[10]。梅邢等[11]使用ABTS+·法、鐵離子還原/抗氧化能力法（FRAP法）、鄰苯三酚自氧化法以及氧自由基吸收能力法（ORAC法）比較了市場上5種不同藻藍蛋白的抗氧化活性，結果表明，在不同測定方法不同體系中，藻藍蛋白抗氧化活性與其純度、色基含量、蛋白質含量三者有一定相關性。

藻藍蛋白具有抗腫瘤功能，能夠抑制人結腸癌SW480細胞增殖[12]、誘導人喉癌HEP-2細胞凋亡[13]、抑制肺癌A549細胞[14]、抑制肺癌LTEP-a-2細胞生長[15]、誘導非小細胞肺癌H1299細胞凋亡且抑制該細胞生長和遷移[16]等。藻藍蛋白在抗腫瘤中的應用，通常具有單獨作用和聯(lián)合其他藥物的作用，其可聯(lián)合光動力療法、聯(lián)合全反式維甲酸以及聯(lián)合藥物等用于癌癥治療[17]。

藻藍蛋白具有抗炎活性，余佳等[18]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)100μg/mL藻藍蛋白能顯著抑制小鼠巨噬細胞RAW 264.7細胞增殖，一定劑量的藻藍蛋白能抑制脂多糖誘導RAW 264.7細胞分泌NO和TNF-α。

藻藍蛋白除了具有抗氧化、抗腫瘤和抗炎生物功能外，還具有免疫調節(jié)活性[1]、抗輻射、促進細胞生長以及神經(jīng)保護等生物學功能[19]。

2 藻藍蛋白的提取與純化

2.1 細胞破碎工藝

細胞破碎工藝的選擇直接影響藻藍蛋白提取效率、空間構象、穩(wěn)定性等，選擇成本低、效率高、損失少的細胞破碎工藝是提取分離純化至關重要的環(huán)節(jié)。選擇適宜的方法破碎細胞壁后，使用水或鹽緩沖液作為提取液，提取液的選擇需確保大部分藻藍蛋白能溶解在提取液中且盡可能減少雜質的溶解，既得藻藍蛋白粗提液[2]。目前細胞破碎主要采用：反復凍融、超聲波、微波、化學試劑處理、酶解、溶脹、勻漿、超細剪切和研磨等方法[20-22]。Yu[22]以C-藻藍蛋白的提取率為評價標準，比較不同工藝的效用，結果顯示溶脹-超細剪切-超聲波處理的藻細胞藻藍蛋白提取效率最高。

2.2 色素蛋白提取工藝

色素蛋白的提取是為了提高藻藍蛋白回收率，為分離純化做鋪墊，提取劑對回收率、活性有直接影響，選擇適宜的提取劑對藻藍蛋白產業(yè)化開發(fā)具有重要的意義。Silveira等[23]研究蒸餾水、10 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)、10 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)、0.15 mol/L的NaCl、10 g/L的CaCl2溶液5種提取劑提取藻藍蛋白，評價提取效率。結果顯示，蒸餾水是一種有效的提取劑，因其成本低，且最優(yōu)條件下藻藍蛋白提取濃度達3.68 g/L。Moraes等[24]以蒸餾水為提取劑，使用干燥、冷凍、研磨等方法控制細胞生物質顆粒直徑大小0.106～0.125 mm，料液比為0.16∶1，無攪拌，25 ℃，提取時間為1 h，該工藝操作簡單、成本低可用于C-藻藍蛋白規(guī)?；崛　?/p>

2.3 分離純化工藝

藻藍蛋白分離純化工藝包括鹽析、色譜分離和萃取等，依據(jù)不同的用途，選擇合適的分離純化工藝，以確保藻藍蛋白的純度適用于應用開發(fā)。其中純度根據(jù)A620/A280的比值劃分為以下幾種等級：食品級（A620/A280≥0.7）、反應級（A620/A280≥3.9）、分析級（A620/A280≥4.0）。

2.3.1 鹽析法

鹽析是在藻藍蛋白粗提液中加入一定濃度的無機鹽溶液（如硫酸銨、檸檬酸三銨鹽、磷酸鈉、檸檬酸鉀和氯化銨溶液）[25，26]，使水化層或者電荷遭到破壞，藻藍蛋白凝聚析出，其中硫酸銨鹽析沉淀常被用于藻藍蛋白分離純化。Maria Kissoudi等[27]使用不同飽和度的硫酸銨鹽溶液，對螺旋藻藻藍蛋白粗提液進行一步鹽析和兩步鹽析，發(fā)現(xiàn)硫酸銨飽和度為50%一步鹽析處理螺旋藻藻藍蛋白粗提液后，獲得食品級藻藍蛋白，其純度為1.28；硫酸銨飽和度為70%一步鹽析處理螺旋藻藻藍蛋白粗提液后，獲得食品級藻藍蛋白，其純度為1.36。硫酸銨飽和度為25%～50%兩步鹽析處理螺旋藻藻藍蛋白粗提液，獲得食品級藻藍蛋白，其純度為1.48；硫酸銨飽和度為25%～70%兩步鹽析處理螺旋藻藻藍蛋白粗提液，獲得食品級藻藍蛋白，其純度為1.81。結果表明：硫酸銨飽和度為25%～70%兩步鹽析處理螺旋藻藻藍蛋白粗提液后獲得的藻藍蛋白純度最高。

2.3.2 色譜法

色譜法是一種操作方便，易于藻藍蛋白工業(yè)化應用的分離純化工藝，其原理是藻藍蛋白在固定相和流動相之間分配平衡的過程。

⑴ 羥基磷灰石柱層析法（Hydroxyapatite column chromatography， HA柱層析）

羥基磷灰石(Hydroxyapatite， HAP)是骨骼的成分，分為天然或人工合成2種，微溶水，弱堿性，分子式為(Ca5(PO4)3OH)2，是一種磷酸鈣晶體，用于分離純化藻藍蛋白具有良好的選擇性[28]。Serena Benedetti等[29]在硫酸銨飽和度為50%下對水華束絲藻藻藍蛋白粗提液中的藻藍蛋白進行沉淀后，置于2.5cm×25cm的羥基磷灰石柱中，用pH 7.0鈉磷酸鹽緩沖液洗脫，離子強度從5 mmol/L增加到150 mmol/L，純化后得到分析級藻藍蛋白，其純度為4.7。于淑坤等[30]將硫酸銨溶液沉淀后獲得的鈍頂螺旋藻藻藍蛋白經(jīng)過1.6 cm×20 cm羥基磷灰石柱分離純化，經(jīng)不同離子強度的磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，純化后得到食品級藻藍蛋白，其純度最高可達到2.1。

⑵ 膨脹床吸附色譜法（Expanded bed adsorption chromatography， EBAC）

膨脹床吸收色譜法是一種能同時對藻藍蛋白粗提液進行澄清、濃縮和提純的理想分離技術。Niu等[31]通過該方法獲得了純度為2.87的食品級藻藍蛋白，工藝流程：先通過0.5 mol/L的硫酸銨溶液沉淀藻藍蛋白，再利用膨脹床（含苯基-Sepharose吸附劑）進一步純化。膨脹床吸收色譜法既可以不損失材料，同時還能保持高C-藻藍蛋白回收，降低了處理成本和時間，可以產業(yè)化開發(fā)。

⑶ 離子交換色譜法（Ion exchange chromatography，IEC）

陰離子交換色譜法進行純化藻藍蛋白，是因為其在弱酸性介質中帶有負電荷。Kuei-Hsiang Chen等[32]使用攪拌流化床離子交換色譜法直接從料液比為1∶10高濁度螺旋藻細胞勻漿液中提取C-藻藍蛋白，經(jīng)攪拌流化床純化后得到的食品級藻藍蛋白，其純度為3.0、回收率為64.25%。于淑坤[30]經(jīng)羥基磷灰石柱層析收集到的鈍頂螺旋藻藻藍蛋白樣品再經(jīng)DEAE-Sephadex-A-25柱層析后，純化得到的分析級藻藍蛋白，其純度最大可達5.4。

⑷ 疏水相互作用層析法（Hydrophobic interaction chromatography， HIC）

疏水相互作用色譜是依據(jù)藻藍蛋白粗提液與具有適度疏水性的填料之間的疏水相互作用而純化藻藍蛋白。Lauceri Rosaria等[33]將藻藍蛋白粗提液加入適量的硫酸銨后，裝在硫酸銨響應的商用親水聚偏氟乙烯(PVDF)膜上進行HIC純化，采用兩步HIC法純化藻藍蛋白，獲得純度為4.20的分析級藻藍蛋白，收率為67.0%。

⑸ 凝膠過濾層析法（Gel filtration， GF）

藻藍蛋白分子大小與其他蛋白間存在差異，因此網(wǎng)狀結構的凝膠分子篩可以使藻藍蛋白與其他物質分離開來，物質在凝膠分子篩中保留時間可以推斷出物質的相對分子質量[34，35]。Pinaki Hazra等[36]從紅樹林分離的藍藻AP24，用硫酸銨對藻藍蛋白粗提物進行連續(xù)沉淀后，經(jīng)離子交換層析柱（DEAE-纖維素DE 52）和凝膠過濾層析柱（Sephadex G-100）純化，提高了藻藍蛋白的純度。

2.3.3 萃取法

雙水相萃?。ˋqueous two-phase extraction，ATPE）是因為藻藍蛋白在2個水相中溶解度存在差異，因此，在雙水相體系中利用藻藍蛋白在2相中的分配差異將其與其他物質進行分離[37，38]。聚乙二醇-硫酸銨、PEG1450-磷酸鹽、PEG2000-酒石酸鉀鈉等雙水相體系常用于藻藍蛋白的分離純化[39-41]。

3 展望

雖然近年來藻藍蛋白的分離純化已經(jīng)取得了一定的進展，但適用于大規(guī)模的工業(yè)生產的關鍵技術仍有待解決。藻藍蛋白在食品工業(yè)、功能保健品、化妝品、制藥工業(yè)等領域發(fā)展具有較高的應用研究價值，但是在開發(fā)過程中，微藻細胞破碎方法、提取分離純化所用的試劑等都可能影響藻藍蛋白產品純度。另外，藻藍蛋白的穩(wěn)定性易受溫度、pH值、光照強度、離子濃度等因素的影響，如何確保藻藍蛋白在提取過程中的穩(wěn)定性也是藻藍蛋白廣泛應用開發(fā)的關鍵。