張 祎，陳桂芳，袁玲玲，丁麗娜，楊衛(wèi)平，楊靜雯，王睿睿,錢(qián)如貴

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院,云南 昆明 650500；2.云南省民族特色養(yǎng)生理論與健康產(chǎn)品工程實(shí)驗(yàn)室,云南 昆明 650500；3.昆明邦宇制藥有限公司,云南 昆明 650211)

保元湯為明代孫志宏所著《簡(jiǎn)明醫(yī)彀》中記載的經(jīng)典方劑，制法為“人參一錢(qián)，黃芪二錢(qián)，甘草五分，肉桂二分.右加生姜一片，水煎服”，可大補(bǔ)元?dú)?，主治元?dú)馓撊踔C[1].根據(jù)古代醫(yī)藥典籍記載的藥方組成，可以將該方開(kāi)發(fā)為增強(qiáng)免疫力功能的產(chǎn)品，符合來(lái)源于經(jīng)典名方、治未病的現(xiàn)代健康理念，本文完成保元湯提取物對(duì)正常小鼠免疫力功能影響的實(shí)驗(yàn)研究，為以保元湯為基礎(chǔ)配方的健康產(chǎn)品研究開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也可為古代經(jīng)典方劑的現(xiàn)代應(yīng)用提供研究思路.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)ICR小鼠，單一性別，體重18～22 g，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(滇)K2015-0002.實(shí)驗(yàn)前在動(dòng)物房環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～26 ℃(日溫差≤3 ℃)，相對(duì)濕度40%～70%，換氣次數(shù)10～20次/h，氣流速度0.1～0.2 m/s，噪音≤60 dB，工作照度>300lx，動(dòng)物照度15～20lx，12 h明暗交替照明，使用許可證：SYXK(滇)K2017-0005.

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

刀豆蛋白A，Sigma，批號(hào)C6110；2,4二硝基氟苯，成都貝斯特試劑有限公司，批號(hào)20180607；青霉素鏈霉素混合液(100×，批號(hào)180625)、姬姆薩染色液(批號(hào)20181208)、印度墨水(批號(hào)20180730)、MTT(批號(hào)298-93-1 )，購(gòu)自北京奧拓科技有限公司；PBS緩沖液(批號(hào)8118127)、RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液(批號(hào)8118314)，購(gòu)自賽默飛世爾儀器有限公司；DM500普通光學(xué)顯微鏡，德國(guó)Leica；SpectraMax Plus384酶標(biāo)儀，美國(guó)MD；5810R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf.

1.3 樣品制備

參照文獻(xiàn)[2]報(bào)告的配方和制備方法，制備200人份的藥材處方為：人參300 g、黃芪600 g、肉桂 60 g、生姜300 g、甘草150 g，經(jīng)水提取，提取物的成人推薦用量為1.75 g/d.

1.4 劑量設(shè)計(jì)與分組

受試物為1.3制備的提取物，每個(gè)試驗(yàn)項(xiàng)目均設(shè)立對(duì)照組和不同劑量的實(shí)驗(yàn)組，每組10～15只動(dòng)物，其中，實(shí)驗(yàn)組分別設(shè)0.15、0.30、0.60 g/kg bw劑量組(為人體推薦用量的5、10、20倍)，受試物以純化水配制，配制后2～8 ℃下保存不超過(guò)3 d，所有實(shí)驗(yàn)組經(jīng)口灌胃給予不同劑量的受試樣品，灌胃容積為20 mL/kg bw，每天1次，每周稱量體重1次，并根據(jù)動(dòng)物體重調(diào)整灌胃體積，對(duì)照組給予等體積的純化水.

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

參考文獻(xiàn)[3-4]方法，采用小鼠碳粒廓清實(shí)驗(yàn)、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和NK細(xì)胞活性測(cè)定，觀察保元湯提取物對(duì)正常小鼠非特異性免疫功能的影響；采用小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、血清溶血素生成實(shí)驗(yàn)、ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，觀察保元湯提取物對(duì)正常小鼠特異性細(xì)胞免疫和體液免疫的影響.

1.5.1 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)

選用雌性小鼠60只，按體重隨機(jī)分為4組，每組15只，連續(xù)給藥30 d，末次給藥后30 min，按 100 mL/kg 尾靜脈注入10%印度墨汁，在注射后2、10 min時(shí)，小鼠眼眶靜脈取血20 μL置于含2 mL 0.1%Na2CO3溶液的試管中混勻，酶標(biāo)儀測(cè)定 600 nm 處吸光度，將動(dòng)物處死，取其胸腺、脾器官稱重，計(jì)算吞噬系數(shù)、胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù).

1.5.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞

選用雌性小鼠48只，隨機(jī)分為4組，每組12只，連續(xù)給藥30 d，在取材前4d給每只小鼠腹腔注射2%壓積雞血紅細(xì)胞0.2 mL，取材時(shí)頸椎脫臼處死小鼠，每只腹腔注射含胎牛血清的FPS液4 mL，吸取腹腔洗液，取0.5 mL洗液加入盛有1%雞血紅細(xì)胞懸液0.5 mL的試管內(nèi)混勻，取0.5 mL混合液于玻片，37 ℃孵育15～20 min，生理鹽水沖洗玻片，置甲醇液中固定1 min，再放入Giemsa溶液中染色15 min，最后用蒸餾水沖洗干凈，晾干，用40×顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞吞噬百分率和吞噬指數(shù).

1.5.3 NK細(xì)胞活性測(cè)定

選用雌性小鼠4只，隨機(jī)分為4組，連續(xù)給藥30 d后，頸椎脫臼處死動(dòng)物，無(wú)菌取脾，在FPS液中磨碎，經(jīng) 1 000 r/min 離心洗滌后，用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，活細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度2×107個(gè)/mL.取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100 μL(效靶比50∶1)，自然釋放孔和最大釋放孔分別加入培養(yǎng)液和2.5%Triton 100 μL，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，1 500 r/min 離心5 min，取上清液100 μL，加入LDH基質(zhì)液100 μL，室溫反應(yīng)3～10 min，加入1 mol/L的HCL 30 μL，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處吸光度，計(jì)算NK細(xì)胞活性.

1.5.4 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)(MTT法)

選用雌性小鼠60只，隨機(jī)分為5組，連續(xù)給藥30 d，頸椎脫臼處死動(dòng)物，無(wú)菌取脾，置無(wú)菌Hank’s液中磨碎，經(jīng) 1 000 r/min 離心洗滌后，將細(xì)胞懸于1 mL的完全培養(yǎng)液中，活細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度3×106個(gè)/mL.將脾細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，一孔加ConA液75 μL，另一孔作為對(duì)照，置37 ℃、5% CO2孵箱中72 h，培養(yǎng)結(jié)束前 4 h，每孔取上清液0.7 mL，加入不含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，加入MTT 50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入酸性異丙醇1 mL混勻，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處吸光度，計(jì)算淋巴細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化能力.

1.5.5 DNFB誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)變態(tài)反應(yīng)

選用雄性小鼠75只，隨機(jī)分為5組，連續(xù)給藥10 d，除空白組外，各組動(dòng)物給藥后1 h，在經(jīng)氯化鋇脫毛的腹部皮膚上均勻涂抹1% DNFB混合液 50 μL，給藥第15 d，各鼠右耳兩面均勻涂抹1% DNFB混合液10 μL，24 h后頸椎脫臼處死動(dòng)物，剪下左右兩耳，用直徑8 mm打孔器于同部位切下雙耳，稱重，計(jì)算腫脹度；同時(shí)摘取胸腺和脾臟，稱重，計(jì)算臟器系數(shù).

1.5.6 血清溶血素的測(cè)定

選用雌性小鼠60只，按體重隨機(jī)分為4組，連續(xù)給藥25 d，每鼠腹腔注射5%綿羊紅細(xì)胞懸液0.2 mL，繼續(xù)給藥5 d，末次給藥后30 min，于眼眶靜脈取血，放置1 h，4 000 r/min 離心10 min，取血清用SA緩沖液稀釋100倍，依次取血清稀釋液0.25 mL、10%綿羊紅細(xì)胞懸液0.25 mL、補(bǔ)體0.25 mL，混合后于37 ℃恒溫30 min，置0～4 ℃冰水中終止反應(yīng)，離心，以不加小鼠血清(以SA緩沖液代替)的空白管調(diào)零，酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm處吸光度，計(jì)算半數(shù)溶血值(HC50).

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)量資料以X±SD表示，采用方差分析，方差齊，計(jì)算F值≥0.05，P≤0.05，用多個(gè)試驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(采用LSD方法)比較試驗(yàn)組與對(duì)照組差異性，試驗(yàn)組顯著水平取P=0.05，極顯著水平P=0.01；對(duì)非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)采用變量轉(zhuǎn)換，或改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 保元湯對(duì)小鼠非特異性免疫的影響

2.1.1 對(duì)小鼠碳廓清的影響

與空白組相比，保元湯對(duì)正常小鼠的碳廓清吞噬指數(shù)未見(jiàn)顯著差異(P>0.05)，胸腺/體重比值和脾臟/體重比值也無(wú)顯著性差異(P>0.05)，結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 保元湯對(duì)小鼠碳廓清的影響

2.1.2 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞功能的影響

與空白組相比，保元湯3個(gè)劑量均可顯著增加正常小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬百分率(P<0.05)，各劑量對(duì)吞噬指數(shù)均無(wú)明顯影響(P>0.05)，結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 保元湯對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞功能的影響

注：與空白對(duì)照組相比，*/**P<0.05/0.01.

2.1.3 對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響

與空白組相比，保元湯各劑量對(duì)正常小鼠NK細(xì)胞活性均無(wú)增強(qiáng)作用(P>0.05)，結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 保元湯對(duì)正常小鼠NK細(xì)胞活性的影響

2.2 保元湯對(duì)小鼠特異性免疫的影響

2.2.1 對(duì)ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

與空白組相比，保元湯中、高劑量均表現(xiàn)出具有增強(qiáng)正常小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 保元湯對(duì)ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

2.2.2 對(duì)DNFB誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

與空白組相比，模型組小鼠耳片腫脹度顯著增加(P<0.01)，胸腺系數(shù)顯著降低(P<0.01)，脾臟系數(shù)未見(jiàn)明顯影響(P>0.05)；與模型組相比較，保元湯3個(gè)劑量均可顯著增加模型小鼠耳片腫脹度(P<0.05或P<0.01)，且呈現(xiàn)出一定的劑量相關(guān)性，具有增強(qiáng)正常小鼠細(xì)胞免疫功能；保元湯中劑量可顯著增加小鼠胸腺系數(shù)(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)表5.

表5 保元湯對(duì)DNFB誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)的影響

注：與空白對(duì)照組相比，**P<0.01；與模型對(duì)照組相比，△P<0.05，△△P<0.01.

2.2.3 對(duì)小鼠血清溶血素生成的影響

與空白組相比較，保元湯3個(gè)劑量均可顯著促進(jìn)正常小鼠血清溶血素的生成(P<0.05或P<0.01)，具有增強(qiáng)正常小鼠的體液免疫功能，結(jié)果見(jiàn)表6.

表6 保元湯對(duì)小鼠血清溶血素生成的影響

注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01.

3 討論與結(jié)語(yǔ)

中醫(yī)藥對(duì)免疫的認(rèn)識(shí)源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，早在兩千多年前，我國(guó)古代醫(yī)學(xué)著作中就有與免疫有關(guān)的記載，如《內(nèi)經(jīng)》中提到“正氣存內(nèi)，邪不可干”、“真氣從之，精神內(nèi)守，病安從來(lái)”等論點(diǎn)，其中真氣就是機(jī)體抵抗病邪的“正氣”[5].免疫力低下，即中醫(yī)的“虛癥”，以扶正固本作為治病的基本法則[6-7].保元湯用于治療元?dú)馓撊酢⒕窬氲?、肌肉柔慢等虛癥，通過(guò)調(diào)節(jié)五臟六腑氣血的陰陽(yáng)平衡來(lái)改善患者的免疫功能，提高患者的免疫力水平[8].現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，保元湯具有免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)免疫細(xì)胞再生和改善造血功能等多種藥理作用，臨床上廣泛用于氣虛、免疫失調(diào)引起的多種疾病[9-10].

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，保元湯提取物以0.15、0.30、0.60 g/kg bw連續(xù)灌胃給藥30 d，可通過(guò)增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬能力，增強(qiáng)正常小鼠非特異性免疫；連續(xù)灌胃給藥15 d，可增強(qiáng)正常小鼠DNFB誘發(fā)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，具有增強(qiáng)正常小鼠特異性細(xì)胞免疫功能；連續(xù)灌胃給藥30 d，可促進(jìn)正常小鼠血清溶血素生成，具有增強(qiáng)小鼠特異性體液免疫功能.在增強(qiáng)細(xì)胞免疫、體液免疫、單核-巨噬細(xì)胞功能等3個(gè)方面結(jié)果均為陽(yáng)性，說(shuō)明保元湯提取物能增強(qiáng)正常小鼠的免疫功能，具有開(kāi)發(fā)為增強(qiáng)免疫力功能產(chǎn)品的前景和優(yōu)勢(shì).

在保元湯配方中具有增強(qiáng)免疫力功能的主要組分為人參、黃芪.根據(jù)文獻(xiàn)[11-13]報(bào)道，人參、黃芪單用或配伍使用，均能不同程度增強(qiáng)小鼠多種免疫功能.本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，保元湯提取物對(duì)小鼠碳粒廓清能力、NK細(xì)胞活性無(wú)顯著影響、ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化無(wú)顯著影響，與文獻(xiàn)報(bào)道存在一定差異，可能是由于各實(shí)驗(yàn)對(duì)受試物或組分的劑量要求不同所致，也可能是由于受試物本身的作用特點(diǎn)所在，有待開(kāi)展進(jìn)一步的作用機(jī)制研究.