周海東，玉藍(lán)青，鐘煥銘，農(nóng)光任，潘朝杰，羅昊翔

(右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000)

肝癌是常見的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年全球和中國肝癌發(fā)病總數(shù)占癌癥總數(shù)的5.6%和12.9%，2013年我國死于肝癌的患者為31.6萬人[1]，嚴(yán)重危害人民健康。目前對于肝癌的治療主要有手術(shù)切除、動脈栓塞等方法，但這些方法在臨床治療中均有一定的副作用，包括惡心、乏力等。曾有不少使用中藥方治愈肝癌的報(bào)道，如廣州中醫(yī)藥大學(xué)周岱翰教授曾使用茵陳蒿湯合五苓散加減辨證施治治療肝癌1例，存活10年以上[2]。研究表明，茵陳蒿湯及其加減方具有護(hù)肝、利膽、抗腫瘤作用，但茵陳蒿湯合五苓散加減方對肝癌的治療機(jī)制尚不清楚，是否與中藥方劑調(diào)節(jié)了體內(nèi)某些分子的變化有關(guān)，目前對此知之甚少。本研究通過使用廣州中醫(yī)藥大學(xué)周岱翰教授治療肝癌的方劑茵陳蒿湯合五苓散加減方，熬制湯藥，對正常小鼠灌胃，觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠肝組織內(nèi)細(xì)胞因子IL-6、IL-18的表達(dá)，為中藥方劑對體內(nèi)微環(huán)境的調(diào)節(jié)尋找證據(jù)，為中醫(yī)藥在臨床治療腫瘤提供分子依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 試劑

中藥購買于百色市一心堂藥店，兔抗鼠anti-IL-6、anti-IL-18(武漢博士德生物公司)，免疫組化試劑盒(武漢博士德生物公司，SA2022)，二甲苯、無水乙醇、95%乙醇等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

昆明種SPF級正常小鼠，2～3月齡，共20只，由右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供(SYXK桂20117-0004)。

1.3 儀器

電熱烤箱(上?；厶﹥x器制造有限公司，型號：DHG-9070A)，顯微鏡(OLYMPUS，型號：CX21)，水浴箱(國營新醫(yī)療器械廠，型號：S648)。

2 方法

2.1 湯藥制備

茵陳蒿湯合五苓散加減方(茵陳蒿20 g、黨參20 g、梔子15 g、茯苓15 g、豬苓15 g、澤瀉15 g、白術(shù)15 g、大黃12 g、半枝蓮30 g、溪黃草30 g)加水1 500 mL，熬制45 min，最終湯藥約750 mL。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及灌胃

對20只小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組各10只，正常喂食、喂水，每次灌胃前將灌胃針煮沸消毒10 min左右，中藥湯劑從4 ℃冰箱取出，37 ℃水浴加熱后，對實(shí)驗(yàn)組灌胃給藥1 mL/只，4 h/次，2次/d，對照組不予處理。

2.3 取材方法

于灌胃第2天后，每天第2次灌胃4 h后，頸椎脫臼處死實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠各1只，無菌取肝臟，甲醛固定。

2.4 免疫組化檢測

將所有小鼠取材后，制作石蠟切片，4 ℃下保存，脫蠟前置于電熱烤箱65 ℃下烘烤20 min，將每張石蠟切片脫蠟至水，PBS溶液洗滌5 min；將切片置于濕盒，滴加3%H2O2，于37 ℃恒溫水浴孵育10 min；用PBS洗滌2次，2 min/次，滴加BSA，37 ℃恒溫水浴封閉；30 min后棄多余BSA，分別滴加兔抗鼠anti-IL-6、anti-IL-18一抗，置于濕盒中，37 ℃水浴孵化2 h；移去一抗，PBS洗滌3次，2 min/次，滴加過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37 ℃濕盒孵育30 min，滴加顯色劑(DAB：A、B、C各25 μL，加純水1 000 μL)，鏡下觀察。

3 結(jié)果

3.1 茵陳蒿湯合五苓散加減方對小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子IL-6的影響

圖1 茵陳蒿湯合五苓散加減方對小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子IL-6的影響

通過圖1可以看出，A圖為對照組小鼠肝組織IL-6免疫組化染色結(jié)果，從結(jié)果可以看出，在對照組正常小鼠中央靜脈和小葉間靜脈管壁都有陽性染色(棕紅色)；B圖為實(shí)驗(yàn)組小鼠使用茵陳蒿湯合五苓散方灌胃第5天肝組織免疫組化的結(jié)果，中央靜脈管壁已無陽性染色，只有小葉間靜脈還有陽性染色；C圖實(shí)驗(yàn)組小鼠使用茵陳蒿湯合五苓散方灌胃第6天肝組織免疫組化的結(jié)果，肝組織未發(fā)現(xiàn)陽性染色部位。

3.2 茵陳蒿湯合五苓散加減方對小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子IL-18的影響

圖2 茵陳蒿湯合五苓散加減方對小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子IL-18的影響

通過圖2可以看出，A圖為對照組小鼠肝組織IL-18免疫組化染色結(jié)果，對照組正常小鼠肝組織內(nèi)部大部分區(qū)域都有細(xì)胞呈陽性染色(棕紅色)；B圖為實(shí)驗(yàn)組小鼠使用茵陳蒿湯合五苓散方灌胃第5天肝組織免疫組化染色的結(jié)果，肝組織內(nèi)部大部分區(qū)域已無細(xì)胞呈陽性染色，只有肝臟邊緣還有部分細(xì)胞呈陽性染色；C圖為實(shí)驗(yàn)組小鼠使用茵陳蒿湯合五苓散方灌胃第6天肝組織免疫組化染色的結(jié)果，肝組織未發(fā)現(xiàn)陽性染色部位。

4 討論

研究表明，炎癥與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，炎癥的遷延不愈可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。IL-6、IL-18是機(jī)體內(nèi)重要的炎癥因子，IL-6或IL-8等炎性細(xì)胞因子的激活，可促進(jìn)肝臟間質(zhì)細(xì)胞纖維化改變。IL-6主要與炎癥的發(fā)生以及腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移相關(guān)，正常情況下機(jī)體內(nèi)IL-6也有表達(dá)[3]，但含量較低，當(dāng)發(fā)生炎癥時(shí)IL-6會被巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞以及T細(xì)胞大量分泌[4]，IL-6可通過STAT3信號傳導(dǎo)通路參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生，活化的STAT3又可上調(diào)TGF-1和下調(diào)其他致炎因子，這些炎癥因子又與抑制抗腫瘤免疫有關(guān)。此外，IL-6的持續(xù)性增高會加速肝細(xì)胞的損傷，迫使肝細(xì)胞發(fā)生“破壞-修復(fù)-破壞”的循環(huán)，在一定程度上參與了腫瘤的發(fā)生[5-9]。FUKE H等[10]對肝癌患者標(biāo)本進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)STAT3的過度激活是IL-6/gp130高表達(dá)的結(jié)果，可見IL-6在肝癌的發(fā)生過程中可能存在重要作用。本實(shí)驗(yàn)研究表明，對照組小鼠肝組織IL-6免疫組化染色顯示小血管管壁明顯強(qiáng)陽性染色，而實(shí)驗(yàn)組經(jīng)茵陳蒿湯合五苓散加減方灌胃后，IL-6的表達(dá)隨著灌胃次數(shù)的增加有逐漸減少的趨勢，于灌胃第5天，肝組織小血管管壁中IL-6的表達(dá)明顯下降，于灌胃第6天，肝組織中IL-6檢測呈陰性，可見茵陳蒿湯合五苓散加減方能調(diào)節(jié)IL-6的表達(dá)，茵陳蒿湯合五苓散加減方可能通過下調(diào)IL-6的表達(dá)，進(jìn)而改變信號通路，達(dá)到護(hù)肝、抗腫瘤的功效。

IL-18也是一種炎癥刺激因子[11]，直接參與肝損傷，其參與肝損傷的機(jī)制可通過PAMPs通路，激活NLRP3炎癥小體，促使Caspase-1成熟，活化的Caspase-1可以使IL-18激活并使之聚集，大量的IL-18浸潤導(dǎo)致細(xì)胞損傷[12]。潮蓉[13]在研究酒精性肝損傷機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，酒精性肝損傷小鼠IL-18表達(dá)明顯增強(qiáng)，說明IL-18也是肝損傷發(fā)生過程中的重要分子。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠肝組織中大部分區(qū)域都有細(xì)胞IL-18呈陽性染色，經(jīng)茵陳蒿湯合五苓散加減方灌胃第5天發(fā)現(xiàn)IL-18陽性染色區(qū)域明顯減少，灌胃第6天，肝組織IL-18未發(fā)現(xiàn)陽性染色，表明茵陳蒿湯合五苓散加減方可調(diào)節(jié)IL-18的表達(dá)，有可能使用茵陳蒿湯合五苓散通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，進(jìn)而達(dá)到護(hù)肝、防治肝損傷乃至預(yù)防和治療肝癌的目的。