馬好運(yùn), 王安佳, 翁愛(ài)珍, 王留洋, 梅向東, 折冬梅, 寧 君

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所 植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

甘藍(lán)夜蛾(MamestrabrassicaeLinnaeus)隸屬于鱗翅目夜蛾科，具有群集性、夜出性和暴食性等特點(diǎn)，在我國(guó)西北、華北和東北等地區(qū)均有出現(xiàn)[1]。目前農(nóng)業(yè)仍依賴化學(xué)農(nóng)藥防治甘藍(lán)夜蛾，目前防治效果較好的化學(xué)藥劑有高效氯氟氰菊酯、溴除蟲菊酯、溴蟲腈和滅多威等[2]，但是對(duì)甘藍(lán)夜蛾綠色防治的研究報(bào)道較少?；瘜W(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用，不僅會(huì)對(duì)人類健康和環(huán)境安全產(chǎn)生威脅，而且會(huì)導(dǎo)致害蟲的抗性問(wèn)題越來(lái)越凸顯，因此迫切需開(kāi)發(fā)和尋找綠色、經(jīng)濟(jì)、高效的害蟲防控新技術(shù)。

昆蟲信息素是昆蟲個(gè)體與同物種其他成員間進(jìn)行通訊的化學(xué)信號(hào)[3]，絕大多數(shù)昆蟲利用這種化學(xué)信號(hào)進(jìn)行定位和特異性識(shí)別，從而完成交配和繁殖[4]。1978年Bestmann等[5]首次采用氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)鑒定出甘藍(lán)夜蛾信息素的主要成分為順-11-十六乙酸酯。Hiria等[6]確認(rèn)了順-11-十六乙酸酯為甘藍(lán)夜蛾的主要成分，并進(jìn)行了田間實(shí)驗(yàn)。Veire等[7]將未交配的雌蟲性腺的提取物進(jìn)行GC-MS分析后，發(fā)現(xiàn)有效成分為順-11-十六乙酸酯、順-11-十七乙酸酯和十六烷基乙酸酯質(zhì)量比為8/1/1，電生理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雄蟲對(duì)順-11-十六乙酸酯的響應(yīng)值較高。此后國(guó)外有關(guān)甘藍(lán)夜蛾信息素組分的鑒定時(shí)有報(bào)道，而國(guó)內(nèi)對(duì)甘藍(lán)夜蛾信息素的研究較少。與化學(xué)農(nóng)藥相比，昆蟲性信息素防治害蟲具有靈敏度高、專一性強(qiáng)、微量高效、使用方便、環(huán)境友好、不誤傷天敵及價(jià)格低廉等特點(diǎn)。進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，人們利用昆蟲信息素干擾交配治理害蟲的面積以幾何級(jí)的速度增加[8-9]。但天然的信息素易于降解、持效期短，長(zhǎng)期單一使用某些性信息素組分可能導(dǎo)致害蟲產(chǎn)生抗性等問(wèn)題[10-11]，因此尋求穩(wěn)定高效、經(jīng)濟(jì)環(huán)保的昆蟲性信息素替代物成為亟待解決的問(wèn)題。

人工合成的(自然界中不存在)但結(jié)構(gòu)與天然性信息素組分相似的性信息素類似物，同樣能調(diào)節(jié)昆蟲的行為，繼而影響昆蟲化學(xué)通訊[12]。Burger等[13]對(duì)蘋果異形小卷蛾(Laspeyresiapomonella)的研究發(fā)現(xiàn)，將合成過(guò)程中的副產(chǎn)物7-乙烯基癸烷乙酸酯，添加到其性信息素組份(Z)-8-十二碳烯乙酸酯和(E)-8-十二碳烯乙酸酯中，可有效地干擾未交配雌蟲或性信息素誘芯對(duì)雄蟲的吸引。Carmen等[14]設(shè)計(jì)合成了一系列蛀莖夜蛾(Sesamianonagrioides)的鹵代烷酯性信息素類似物，在EAG試驗(yàn)中均能顯著降低雄蟲對(duì)性信息素的響應(yīng)值。將類似物與性信息素以質(zhì)量比1/10混合時(shí)，能顯著地干擾雄蟲對(duì)雌蟲性信息素的識(shí)別及定位。董夢(mèng)雅等[15]以小菜蛾信息素(Z)-11-十六碳烯乙酸酯為母體結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)合成了多種性信息素類似物，并進(jìn)行了室內(nèi)活性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)合成的信息素類似物能有效干擾雄蟲對(duì)誘芯的定位，對(duì)昆蟲的求偶過(guò)程產(chǎn)生迷向作用。陳展冊(cè)等[16]對(duì)9種綠盲蝽性信息素類似物進(jìn)行了活性驗(yàn)證。室內(nèi)觸角電生理反應(yīng)試驗(yàn)表明，綠盲蝽對(duì)其中的反-2-丁酸己烯酯EAG響應(yīng)值最高。Den等[16]通過(guò)單細(xì)胞記錄顯示，在順-11-十六乙酸酯中添加順-9-十四乙酸酯和順-11-十六醇，能影響使雄蟲產(chǎn)生逃避反應(yīng)的B類型感覺(jué)細(xì)胞的活性。

本文以此為基礎(chǔ)，根據(jù)甘藍(lán)夜蛾信息素的主要成分順-11-十六乙酸酯的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行了兩種不同類型的結(jié)構(gòu)修飾。(1)極性基團(tuán)的修飾，即對(duì)甘藍(lán)夜蛾性信息素上的酯鍵進(jìn)行含氟或含溴基團(tuán)的取代。(2)碳鏈雙鍵的修飾，即將氟原子引入性信息素的碳鏈雙鍵上，使其成為含氟的飽和化合物。合成的4種類似物(G1～G4， Scheme 1～Scheme 2)的結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR, GC-MS和HR-MS(ESI)等表征。采觸角電生理試驗(yàn)(EAG)初步測(cè)試了G1～G4的生物活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker DPX-300 MHz型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo))；Bruker solariX型質(zhì)譜儀；Syntech型觸角電位儀。

甘藍(lán)夜蛾成蟲采集于北京市延慶區(qū)舊縣鎮(zhèn)有機(jī)農(nóng)業(yè)示范園;羽化未交配成蟲來(lái)自于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，[飼養(yǎng)條件為：(25±3)℃，相對(duì)濕度(70±10)%，光周期16 h/8 h(L/D)]，將羽化的成蟲單獨(dú)置于指型管中，并用10%的紅糖水飼養(yǎng)備用;其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)G1和G2的合成(以G1為例)

將反-11-十六碳烯-1-醇0.5 g溶于15 mL重蒸二氯甲烷中，加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)0.01 g，三乙胺(TEA)0.32 g，于冰鹽浴中不斷攪拌，緩慢滴加3-氯丙酸酐0.32 g，滴畢，反應(yīng)2 h(TLC跟蹤)。用去離子水淬滅反應(yīng)，分液，有機(jī)相依次用飽和食鹽水(3×25 mL)洗滌，無(wú)水硫酸鎂干，過(guò)濾，有機(jī)相經(jīng)減壓蒸除溶劑，經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/50]純化得目標(biāo)產(chǎn)物反-11-十六碳烯-3-氯丙酸酯(G1)。用類似的方法合成反-11-十六碳烯-2-溴丙酸酯(G2)。

Scheme 1

Scheme 2

G1： 淡黃色油狀液體，收率63%；1H NMRδ: 0.90(t,J=6.92 Hz, 3H), 1.30(m, 18H), 1.64(m, 2H), 2.01(m, 4H), 2.79(t,J=6.72 Hz, 2H), 3.76(t,J=6.72 Hz, 2H), 4.12(t,J=6.72 Hz, 2H), 5.36(m, 2H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 14.0, 22.7～22.9(2C), 25.2～25.6(3C), 29.9～30.0(7C), 32.6, 52.5, 68.5, 129.8～130.3(2C), 158.4； HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C19H35O2ClNa{[M+Na]+}339.206678, found 339.206871。

G2： 黃色油狀液體，收率44%；1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 0.89(t,J=8.48 Hz, 3H), 1.30(m, 18H), 1.67(m, 2H), 1.82(d,J=6.72 Hz, 2H), 2.00(m, 4H), 4.16(t,J=9.11 Hz, 2H), 4.37(m, 1H), 5.35(m, 2H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 13.9, 21.7～22.3(2C), 25.7, 29.1～29.7(7C), 31.8～32.6(3C), 40.2, 66.1, 68.5, 129.8～130.3(2C), 170.3; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C19H35O2BrNa{[M+Na]+}397.171809, found 397.171547。

(2)G3和G4的合成

將催化劑3,5-二(2-甲氧基-2-氧乙氧基)-4-碘苯甲酸甲酯0.02 g，間氯過(guò)氧苯甲酸(mCPBA)0.45 g和無(wú)水二氯甲烷50 mL加入聚乙烯平底燒瓶中，通入氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣，加入順-11-十六碳烯-1-醇0.5 g。用注射器吸取70%吡啶氫氟酸鹽2.5 g，緩慢加入反應(yīng)體系中，攪拌下反應(yīng)12 h(TLC檢測(cè))。放入低溫槽中，于-78 ℃分批加入堿性氧化鋁15 g，加畢，反應(yīng)0.5 h。緩慢升至室溫，過(guò)濾，濾液依次用飽和Na2SO3溶液洗滌除去m-CPBA，用飽和食鹽水(3×25 mL)洗滌除去水溶性雜質(zhì)，無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾，減壓蒸除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/6]純化得11,12-二氟十六烷基-1-醇(G3)。用類似的方法合成11,12-二氟十六烷基乙酸酯(G4)。

G3： 淡黃色油狀液體，收率30%；1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 0.92(t,J=11.88 Hz, 3H), 1.49(m, 24H), 3.59(m, 2H), 4.32(s, 1H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 14.0, 22.7～22.8(2C), 25.0～25.6(4C), 29.6～30.3(5C), 33.2, 62.8, 96.0(2C), 170.3; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C16H32OF2Na{[M+Na]+}301.231886, found 301.231458。

G4： 淡黃色油狀液體，收率26%；1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 0.92(t,J=13.78 Hz, 3H), 1.52(m, 24H), 2.17(s, 3H), 4.05(t,J=13.50 Hz, 2H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 13.9, 20.9, 22.5～22.6(2C), 25.0～25.8(4C), 29.6～31.2(6C), 64.6, 95.4, 97.6, 171.2; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C18H36O2F2Na{[M+Na]+}343.242457, found 343.242618。

1.3 室內(nèi)生物活性測(cè)試

準(zhǔn)確稱取4種類似物分別溶于色譜純正己烷中，配置成0.1 μg/μL、 1 μg/μL、 10 μg/μL、 100 μg/μL的待測(cè)溶液。并將不同濃度的信息素類似物組分均勻地涂抹在對(duì)折過(guò)的濾紙條上(長(zhǎng)6 cm，寬1 cm)，待測(cè)溶劑揮發(fā)后將濾紙放入巴斯德管(長(zhǎng)22.5 cm，內(nèi)徑6 mm)，以分析純的正己烷作為對(duì)照，為保證測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性，含有信息素類似物的濾紙條需現(xiàn)配現(xiàn)用。

將指型管中羽化2～3 d的甘藍(lán)夜蛾成蟲進(jìn)行分類，從中挑選出健康的雄性甘藍(lán)夜蛾進(jìn)行EAG實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前黑暗處理2 h，以模擬田間自然條件[17]。在顯微鏡下將雄蟲的觸角完整取出，然后用刀片將觸角的尖端末尾切下。切好的觸角通過(guò)裝有0.1 M氯化鉀溶液的玻璃電極連接在探頭上，組成閉合回路。為保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每頭昆蟲用一根觸角，每個(gè)類似物的不同濃度做3個(gè)重復(fù)。對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用SPSS 20.0分析軟件，顯著差異性分析利用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

(1)對(duì)甘藍(lán)夜蛾信息素極性基團(tuán)的修飾，由于溴原子的空間位阻較大，且氯原子的供電子效應(yīng)大于溴原子，因此含氯的類似物的收率高于含溴的類似物，且反應(yīng)速度較快。(2)對(duì)甘藍(lán)夜蛾信息素碳鏈雙鍵的修飾，反應(yīng)在丙酮和液氮控制的-78 ℃條件下，保證了反應(yīng)體系中多余酸的緩慢中和，減少了副產(chǎn)物的發(fā)生。在進(jìn)行柱層析過(guò)程中，由于類似物G3、G4的極性較小，在選擇展開(kāi)劑時(shí)，當(dāng)展開(kāi)劑為乙酸乙酯/石油醚=1/30或1/20時(shí)，目標(biāo)化合物與雜質(zhì)不能完全分離，當(dāng)展開(kāi)劑為乙酸乙酯/石油醚=1/10時(shí)，目標(biāo)化合物與雜質(zhì)基本分離，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的篩選，最終確定最佳的展開(kāi)劑為乙酸乙酯/石油醚=1/6。此外，添加催化劑3,5-二(2-甲氧基-2-氧乙氧基)-4-碘苯甲酸甲酯能大幅度的提高反應(yīng)速率。

楊新玲等[18]用AccuModel和PowerFit軟件比較了蚜蟲報(bào)警信息素EBF的氟取代類似物與EBF的結(jié)構(gòu)相似性，并對(duì)非EBF系列物結(jié)構(gòu)活性關(guān)系進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)一氟取代化合物與EBF的結(jié)構(gòu)相似，并推測(cè)一氟類似物可能有較好的活性。本文合成的含氟甘藍(lán)夜蛾信息素類似物，氟原子與氫原子結(jié)構(gòu)相似，能夠準(zhǔn)確的定位于昆蟲性信息素受體位點(diǎn)，同時(shí)氟原子電負(fù)性較強(qiáng)，使得類似物分子具有極性和非極性的雙重特性；使得類似物在通過(guò)昆蟲磷脂雙分子層時(shí)，能更有效地被昆蟲嗅覺(jué)受體識(shí)別以及轉(zhuǎn)化為電位信號(hào)進(jìn)行傳導(dǎo)[19]，因而推測(cè)含氟的甘藍(lán)夜蛾性信息素類似物有較好的田間生物活性。

2.2 表征

以G4為例，分析了目標(biāo)產(chǎn)物的1H NMR譜圖。受羰基吸電子基團(tuán)的影響，與羰基相連的末端CH3上氫的化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)，δ2.12附近表現(xiàn)為單峰。受氧原子電子云誘導(dǎo)效應(yīng)的影響，與氧相連的亞甲基CH2的氫化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)，同時(shí)受臨近碳原子上氫的耦合作用的影響，表現(xiàn)為三重峰，特征峰位于δ4.08附近。化合物末端CH3上的氫，受臨近碳原子上氫原子的耦合作用影響，表現(xiàn)為三重峰，特征峰位于δ0.90附近。由于氟原子的電負(fù)性最大，與氟相連的兩個(gè)碳原子上的氫受氟原子電負(fù)性的影響，化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)，特征峰位于δ3.62和δ4.38附近。其他24個(gè)氫原子的化學(xué)位移則在高場(chǎng)δ1.49附近。

δ圖1化合物G4的1H NMR譜圖

2.3 EAG活性

本文對(duì)4種類似物進(jìn)行了雄蟲觸角電生理反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，甘藍(lán)夜蛾對(duì)合成的4種結(jié)構(gòu)新穎的類似物均有響應(yīng)值，但響應(yīng)值較小，在低濃度時(shí)與空白差異無(wú)顯著性，但隨著化合物濃度的增大，響應(yīng)值也不斷增加，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)田間實(shí)驗(yàn)具有一定的指導(dǎo)作用。

表1 甘藍(lán)信息素類似物直接刺激EAG活性*

本文設(shè)計(jì)合成4種結(jié)構(gòu)新穎的甘藍(lán)夜蛾信息素類似物，受空間位阻和電負(fù)性的影響，在合成G1、G2的反應(yīng)中，含氯的類似物的反應(yīng)速率大于含溴的類似物。在合成G3、G4的反應(yīng)中，以丙酮和液氮為冷卻介質(zhì)，將反應(yīng)溫度控制在-78 ℃左右，減少了副產(chǎn)物地發(fā)生。為保證反應(yīng)完全，加入過(guò)量的氫氟酸，反應(yīng)完全后用堿性氧化鋁除去多余的酸。室內(nèi)活性測(cè)定表明甘藍(lán)夜蛾對(duì)4種類似物均有一定的響應(yīng)，且隨著所用類似物濃度的增大，響應(yīng)值也不斷增加，但這些類似物是否具有較好的田間生物活性，有待于進(jìn)一步研究。可見(jiàn)，昆蟲信息素類似物對(duì)昆蟲交配行為的干擾和抑制是一種合理的行為控制方法，能夠有效解決天然信息素田間易降解、持效期短等問(wèn)題，為甘藍(lán)夜蛾的綜合防治提供了新思路。