陳宏，張偉，郭建波，宋倩男，王偉明

(1.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

肺纖維化是最常見的肺間質(zhì)疾病，也是呼吸系統(tǒng)最嚴(yán)重的疾病之一[1]。隨著空氣污染日益嚴(yán)重，霧霾的頻發(fā)，發(fā)病率也正在逐步提高。肺纖維化目前治療藥物匱乏，患者的死亡率高,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，肺纖維化患者的病死率要高于很多腫瘤患者[2-3]，患者最終會(huì)因呼吸衰竭而死亡，因此尋找肺纖維化治療藥物具有重要的意義。本課題組通過(guò)動(dòng)物模型對(duì)地龍?zhí)崛∥锟狗卫w維化的有效成分進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

雌性小鼠60只，體質(zhì)量18～22 g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

1.2 主要試劑及藥物

鹽酸平陽(yáng)霉素(鹽酸博萊霉素)，8 mg/支，哈爾濱博萊制藥有限公司生產(chǎn)；羥脯氨酸測(cè)試盒，哈爾濱佰億成生物科技發(fā)展有限公司;地龍飲片，由本院中藥飲片室提供。

1.3 方法

1.3.1 模型的制備

小鼠購(gòu)回后于室溫20 ℃，自然光照條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。采用博萊霉素氣管內(nèi)注入法復(fù)制大鼠肺纖維化模型。采用暴露式氣管內(nèi)注入法，待麻醉后將大鼠仰臥固定，消毒并切開頸部皮膚，逐層鈍性分離軟組織，暴露氣管,給予鹽酸平陽(yáng)霉素，給藥量為8.5 mg/kg，正常對(duì)照組手術(shù)方法相同，氣管內(nèi)注入等量生理鹽水。

1.3.2 分組與處理

60只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和地龍組。地龍組于造模后第2日起給予地龍水提物1.45 g/(kg·d)灌胃；正常對(duì)照組、模型組給予等容積生理鹽灌胃。共飼養(yǎng)4周，取材分7 d、28 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行，每次每組10只動(dòng)物。取右肺下葉組織，用4%的甲醛溶液固定2 d后，做病理檢查。取右肺中葉組織0.02 g，于-20 ℃冰箱保存，備測(cè)羥脯氨酸(NYP)含量。

1.3.3 指標(biāo)的測(cè)定

肺系數(shù)=肺重/體質(zhì)量；肺組織病理改變；肺組織HYP含量測(cè)定(堿水解法)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組肺系數(shù)變化情況比較

地龍組與模型組比較，肺指數(shù)明顯降低(P<0.05)；7 d時(shí)，模型組、地龍組的肺系數(shù)與正常對(duì)照組比較，P<0.05，地龍組與模型組比較，P>0.05；28 d時(shí)，正常對(duì)照組、地龍組與模型組比較，P<0.05。結(jié)果如表1所示。

表1 各組肺系數(shù)變化的比較

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

2.2 各組肺病理形態(tài)學(xué)變化

光鏡下，正常對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)明顯炎癥；其他3組在7 d時(shí)均出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞間隔水腫增厚，各組間鏡下差異不明顯；28 d除正常對(duì)照組外，各組均有不同程度的纖維化改變，纖維組織增生間隔增寬，模型對(duì)照組尤為嚴(yán)重，地龍組顯示輕度纖維化改變。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理改變(HE，×200)

2.3 各組肺組織勻漿羥脯氨酸的測(cè)定

7 d時(shí)，模型組與對(duì)照組相比差異明顯(P<0.05)，28 d時(shí)，地龍組和正常對(duì)照組比較差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，與模型組比較也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果如表2所示。

表2 各組肺組織勻漿羥脯氨酸的測(cè)定結(jié)果比較

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05。

3 討論

肺纖維化是間質(zhì)性肺疾病(ILD) 常見的臨床病理改變；以成纖維細(xì)胞的大量增殖及細(xì)胞外基質(zhì)聚集為主要病變特征；呼吸衰竭是肺纖維化患者的最終臨床表現(xiàn)[4]?；颊叩闹形簧鏁r(shí)間為2～3年，5年病死率達(dá)到40%，自然緩解率非常低 (<1%)[5-6]。纖維化的致病因素廣泛，空氣污染、各種粉塵、射線損傷、某些藥物和疾病等均可以引起肺纖維化；查不出病因的肺纖維化患者，稱之為特發(fā)性肺纖維化[7]。

肺部間質(zhì)組織發(fā)炎的原因包括空氣污染物、過(guò)敏原、細(xì)菌或病毒、吸入有毒氣體、空氣微粒以及香煙等。當(dāng)肺部組織受到刺激，造成免疫反應(yīng)發(fā)生，大量白細(xì)胞自肺部微血管浸潤(rùn)至肺組織中，分泌許多炎性因子[8]：TNF-α、IL-6、IL-8，白細(xì)胞分泌的炎性因子會(huì)吸引更多的白細(xì)胞浸潤(rùn)，使得發(fā)炎癥反應(yīng)加劇，而白細(xì)胞分泌的蛋白酶會(huì)傷害肺部組織。肺纖維化是由于肺臟受到傷害后，在修復(fù)的過(guò)程中失調(diào)，肌纖維細(xì)胞及膠原蛋白過(guò)度增生，使肺部間質(zhì)形成大量纖維結(jié)締組織。肺部纖維化典型癥狀主要有呼吸困難、逐漸惡化之呼吸急促和干咳。肺部纖維化早期咳嗽無(wú)痰，中晚期之后會(huì)有少量黏痰，且易出現(xiàn)繼發(fā)感染，痰液會(huì)出現(xiàn)膿痰或血痰。肺纖維化可分為繼發(fā)性和特發(fā)性，繼發(fā)性肺纖維化是由于其他疾病導(dǎo)致的二次反應(yīng)，如[9]：自體免疫疾病、肺部感染細(xì)菌或病毒、接受放射線治療等，特發(fā)性肺纖維化是致病原因不明。肺纖維化疾病特征為肺泡組織破壞并伴隨著纖維母細(xì)胞/肌纖維母細(xì)胞異常增生和細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度合成與堆積。另外近幾年研究證實(shí)，氧化壓力是造成肺纖維化的機(jī)制之一，在肺纖維患者的肺纖維細(xì)胞中NADPH oxidase4(NOX4)表現(xiàn)量比正常人多，且NOX4是TGF-1促進(jìn)纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的重要因子。

最近的藥理學(xué)研究表明，地龍具有退熱作用，可減輕支氣管平滑肌痙攣，抗纖維原性。在許多研究中證實(shí)了地龍?jiān)诓煌碳は碌募膊∧Ｊ街?，在不同的器官具有抗發(fā)炎及氧化壓力的效用，即便如此，在肺部發(fā)炎相關(guān)疾病的模式中其保護(hù)效果仍尚未清楚，且作用機(jī)轉(zhuǎn)也須更進(jìn)一步研究。雖然地龍對(duì)肺纖維化治療作用已有文獻(xiàn)報(bào)道[10]，但是對(duì)其藥效研究尤其是在多種肺纖維化模型上的評(píng)價(jià)并沒有系統(tǒng)研究，此外，其治療肺纖維化的分子機(jī)制也尚未被闡明，這一定程度上限制了該藥物的在肺纖維化治療上的應(yīng)用。本文通過(guò)建立博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化動(dòng)物模型，模擬致病因素導(dǎo)致的肺纖維化；利用模型對(duì)地龍?zhí)崛∥镞M(jìn)行全面的藥效學(xué)檢測(cè)，尋找藥物的敏感模型，本研究表明，地龍組與模型組比較，肺指數(shù)明顯降低(P<0.05)；病理結(jié)果明顯好于模型對(duì)照組；HYP含量也明顯降低(P<0.05)。因此，地龍?zhí)崛∥锟刹煌潭雀纳撇┤R霉素所致的小鼠肺纖維，通過(guò)研究能夠?yàn)榕R床上針對(duì)不同類型的肺纖維化患者的合理使用提供數(shù)據(jù)支持。