張鄧壯 張艷玲 胡明鑫 劉佰明 谷希樹

摘? ? 要：煙粉虱是一種世界性害蟲，入侵世界許多地區(qū)，其攜帶的番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus， TYLCV）給番茄生產(chǎn)造成了嚴重的損失。煙粉虱的種類繁多，給綠色防控帶來許多困難。為了明確煙粉虱的種類，本試驗主要對天津周邊，還有山東、山西和湖北等省市10個地區(qū)不同寄主共16個煙粉虱種群進行了隱種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析。結果表明，其中13個煙粉虱種群只有MED隱種，3個煙粉虱種群中MEAM1和MED隱種共存。MEAM1隱種煙粉虱的同源性高達100%，MED隱種煙粉虱的同源性為99.6%～100%，入侵我國的MED隱種可能起源于地中海西部地區(qū)。本研究明確了監(jiān)測地區(qū)煙粉虱隱種及其進化關系，為當?shù)責煼凼姆揽靥峁┝丝茖W依據(jù)。

關鍵詞：煙粉虱;系統(tǒng)樹;隱種;系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號：Q966? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.03.004

Species Identification and Phylogenetic Analysis of Bemisia tabaci in Tianjin and Surrounding Areas

ZHANG Dengzhuang1，2， ZHANG Yanling3， HU Mingxin2，4， LIU Baiming2， GU Xishu2

（1.College of Life Science， Tianjin Normal University， Tianjin 300387， China; 2.Tianjin Institute of Plant Protection， Tianjin 300384， China; 3.Vegetable Technology Promotion Station of Ninghe District， Tianjin City，Tianjin 301500， China;4.College of Modern Agriculture and Ecological Environment， Heilongjiang University， Harbin， Heilongjiang 150080， China）

Abstract： As a worldwide pest， Bemisia tabaci has invaded many regions of the world. The tomato yellow leaf curl （TYLCV） virus it carries has caused serious losses. There are many species of Bemisia tabaci， which brings many difficulties to green prevention and control. In order to clarify the species of Bemisia tabaci， in this experiment， a total of 16 species of Bemisia tabaci in different regions of Tianjin and its vicinity， Shandong Shanxi，Hubei were collected to perform species identification and phylogenetic analysis. The results showed that 13 populations only contained Bemisia tabaci MED， 3 populations contained both Bemisia tabaci MEAM1 and Bemisia tabaci MED. Among our collected samples， the homology of Bemisia tabaci MEAM1 was 100%， and The homology of Bemisia tabaci MED was 99.6%～100%.China's MED may originate in the western Mediterranean. This study illustrated the species and evolutionary relationships of Bemisia tabaci in the monitored areas， providing a scientific basis for the prevention and control of Bemisia tabaci in these areas.

Key words： Bemisia tabaci; phylogenetic tree; species; phylogenetic

煙粉虱Bemisia tabaci（Gennadius）是一種多食性農(nóng)業(yè)害蟲，能危害600多種寄主植物，為害方式包括通過吸取植物汁液、分泌蜜露影響光合作用直接危害植物，還可以通過傳播200多種植物病毒間接危害植物[1-2]，番茄黃化曲葉病毒能侵染多種植物，在番茄上的為害尤為嚴重，嚴重時導致絕收[3]。煙粉虱有非常復雜的遺傳結構，目前認為煙粉虱至少是由36個隱種組成的物種復合體[4-5]。其中MEAM1隱種（B型）和MED隱種（Q型）煙粉虱入侵性最強、為害最重。煙粉虱侵入我國時間較長，在20世紀90年代MEAM1煙粉虱就開始入侵我國，之后迅速蔓延到全國各地。而MED煙粉虱則入侵較晚，于2003年在云南首次發(fā)現(xiàn)，但是在最近十年中MED煙粉虱已經(jīng)取代了MEAM1煙粉虱成為中國主要的煙粉虱類型[6-7]。不同煙粉虱隱種具不同的生物學特性，如MEAM1和MED隱種煙粉虱的傳播植物病毒能力和對殺蟲劑抗性存在明顯差異[8-9]。MED隱種的遺傳多樣性要比MEAM1更加豐富，因而其適應環(huán)境的能力更強，能更好的抵御外界不利因素，例如農(nóng)藥、化學藥劑等，MED隱種對新煙堿類殺蟲劑的抗性更強[10]。近年來，國內(nèi)研究者已逐漸重視田間煙粉虱隱種的監(jiān)測，監(jiān)測的地區(qū)包括新疆、北京、湖南、江蘇、陜西、湖北等，為科學防治煙粉虱提供了理論依據(jù)[11-15]。本研究主要立足于天津各區(qū)及其周邊地區(qū)，同時與其他省份的地區(qū)作比較，采用煙粉虱mtDNA COI基因作為分子標記，對天津各區(qū)、北京、山東、山西和武漢等地區(qū)不同寄主植株的煙粉虱種群進行隱種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析，旨在為合理的防治天津地區(qū)煙粉虱提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

采集了天津（西青、靜海、大港、津南、武清）、北京海淀、山東濟南、山西運城、山西大同以及湖北武漢共10個地區(qū)不同寄主的16個種群的煙粉虱成蟲，所采集到的樣品直接浸泡于1.5 mL裝有無水乙醇的離心管中，保存在-20 ℃冰箱中備用。具體采集信息及登錄號見表1。

1.2 方 法

1.2.1 單頭煙粉虱總DNA的提取 參照柳洋[16]的方法，使用KAPA DNA提取試劑盒對煙粉虱DNA進行提取。用昆蟲針取一頭煙粉虱至2 mL離心管中，加入滅菌后的研磨珠，向離心管中加入30 μL配好的DNA提取混合液，將加入提取液的離心管放入組織破碎儀中研磨1 min，8 000 rpm離心30 s，取上清至新的PCR管中并放入PCR儀中進行酶促反應，反應程序為：蛋白酶75 ℃裂解10 min，95 ℃滅活酶5 min。-20 ℃冰箱長期保存。

1.2.2 mtCOI擴增及酶切鑒定煙粉虱生物型 進行PCR反應擴增mtCOI基因片段，反應程序參照柳洋[16]，引物為：C1-J-2195'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAA

GT-3'）和R-BQ-2819（5'-CTGAATA TCGRCGAGGCA

TTCC-3'），擴增產(chǎn)物大小為620? bp左右。

參照 Chu 等[17]的方法，應用限制性內(nèi)切酶 AseI 酶切已擴增到的 620 bp mtCOI 基因片段，通過酶切產(chǎn)物可判斷煙粉虱的生物型。

用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用凝膠成像儀觀察并記錄結果。

1.2.3 mtCOI基因序列測序及數(shù)據(jù)分析 進行PCR反應，反應程序參照 Simon 等[18]的方法，引物為：C1-J-2195（5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3'）和L2-N-3014（5'-TCCAA TGCACTAATCTGCCA

TATTA-3'），擴增產(chǎn)物為COI基因3'末端的部分序列，大小為840 bp左右。將PCR產(chǎn)物純化后送往天津擎科生物科技有限公司進行雙向測序，每個種群至少檢測3頭煙粉虱。

將測序結果提交 GenBank，獲取登錄號（表1），通過BLAST方法檢索有代表性國外煙粉虱COI序列（表2）。在16個種群中，從13個只有MED煙粉虱的種群各抽選一條測序結果;在MEAM1、MED煙粉虱共存的3個種群中，不同的隱種煙粉虱各抽選一條測序結果。以非洲小粉虱[Bemisia afer（ Priesner & Hosny）]（AF418673.2）為外群[19]。運用MEGA 7軟件，根據(jù) Kimura 2- paramter 模型計算出采樣地區(qū)煙粉虱與國內(nèi)外不同地理種群及不同生物型煙粉虱的進化分歧矩陣，利用鄰位法（neighbor-joining，NJ）和最大似然法（maximum likelihood，ML）分別構建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支進行1 000次的重復檢驗。

2 結果與分析

2.1 鑒定不同地區(qū)煙粉虱生物型檢測結果

MED煙粉虱的 mtCOI 基因片段存在一個 AseI 酶切位點，因而可以被酶切成兩個片段（498 bp 和122 bp），而 MEAM1 煙粉虱的 mtCOI 基因由于不存在 AseI 酶切位點，因此不能被切開[10]。

結果顯示16個種群中，有13個種群的煙粉虱都是MED型，有3個種群是MEAM1、MED混合，且混合種群中以MED為主（表3）。

2.2 根據(jù)mtDNA COI序列構建進化分歧和系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.1 構建進化分歧 非洲小粉虱和其他種群煙粉虱的遺傳距離都在28%以上，MEAM1煙粉虱和MED煙粉虱的遺傳距離基本在4.7%～5.6%之間，我們檢測地區(qū)的MED煙粉虱的遺傳距離在0%～0.4%之間，與中國Q型和云南昆明煙粉虱的遺傳距離基本在0.2%之間，低于已知MED煙粉虱的內(nèi)部差異。三個地區(qū)的MEAM1煙粉虱同源性高達100%（表4、表5）。

2.2.2基于mtDNA COI基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹 使用NJ法構建系統(tǒng)樹，各分支均進行1 000次的重復檢驗（圖1）。從進化樹中可以看出， MED煙粉虱以99%的置信度聚為一個分支，且測得的所有MED煙粉虱與來自法國、摩洛哥和西班牙的MED煙粉虱親緣關系更近，而來自土耳其的則單獨聚為一支。所有的MEAM1煙粉虱聚為一支。使用ML法和NJ法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹結果相似（圖2）。

3 討 論

近十年來，我國煙粉虱的優(yōu)勢隱種逐漸由MED代替了MEAM1，其傳播的TYLCV對我國大部分地區(qū)的番茄造成嚴重的危害，對殺蟲劑抗藥性的問題也日益突出[20]。煙粉虱是一個復雜的物種復合體，不同隱種之間傳播TYLCV和對殺蟲劑抗藥性也都有所差異。明確天津各地區(qū)煙粉虱的隱種現(xiàn)狀，與世界各地不同隱種煙粉虱之間的系統(tǒng)發(fā)育分析，可對外來入侵煙粉虱的防治具有重要的指導意義。

本文通過 mtDNA COI基因序列分析鑒定了天津各區(qū)及其附近、山東、山西、湖北等不同地區(qū)煙粉虱的隱種組成和系統(tǒng)生物發(fā)育分析，檢測的隱種和系統(tǒng)發(fā)育樹共同表明在監(jiān)測的各個地區(qū)的不同寄主植株上的煙粉虱絕大部分是都是MED煙粉虱，只有極少數(shù)的種群存在MEAM1煙粉虱，這與現(xiàn)在MED煙粉虱是主要隱種的現(xiàn)狀是相符的。在2009年，Pan等[7]調(diào)查了天津西青區(qū)的煙粉虱隱種，煙粉虱全部是MEAM1隱種，而今調(diào)查天津各區(qū)煙粉虱隱種幾乎都是MED，與褚棟等[21]的結論也一致。

許麗麗等[22]推測中國MED煙粉虱可能起源于地中海西部地區(qū)，我們調(diào)查地區(qū)的MED隱種與來自法國、摩洛哥和西班牙的MED煙粉虱親緣關系更近，土耳其的則單獨聚為一支，結果相似，為這一推測再添實例，更進一步的證明推測的正確性。

不同隱種對寄主植株的危害程度是不同的，MED煙粉虱在番茄上的危害程度比MEAM1煙粉虱更加嚴重[23]。有研究表明，MED煙粉虱比MEAM1煙粉虱對新類煙堿農(nóng)藥具有更高的抗性[24]。這意味著這些地區(qū)的煙粉虱種群對新類煙堿農(nóng)藥有較高的抗性，而目前煙粉虱的治理主要通過噴施農(nóng)藥等化學途徑，這為防治煙粉虱加大了難度。

本研究中由于采樣地點、數(shù)量、方式等局限性，不排除13個種群只檢測出MED煙粉虱的種群是混合種群的可能，因此需要持續(xù)對天津各地區(qū)煙粉虱進行隱種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析，明確各地區(qū)煙粉虱的詳細情況，為科學的防治煙粉虱提供理論依據(jù)。

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