安寧，黃瑾妍，江煒，許昕怡，鄧雅方，楊育昆，陳艷芬

(廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

皮膚軟組織感染包括急性皮膚軟組織感染(如癤、膿腫、急性蜂窩組織炎等)和慢性難愈合創(chuàng)面(如慢性潰瘍、燒燙傷、褥瘡等)繼發(fā)感染。目前皮膚感染主要依靠抗菌藥物治療或通過(guò)外科手術(shù)及時(shí)清創(chuàng)引流后再輔助于一定的抗菌藥物治療。因此，抗菌藥物在皮膚感染治療過(guò)程中的作用不容置疑，但其毒副作用如過(guò)敏反應(yīng)、二重感染及日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性問(wèn)題等使其應(yīng)用受到一定限制[1-3]。近年來(lái)有較多文獻(xiàn)報(bào)道中藥抗菌的優(yōu)勢(shì)[4-5]，中藥抗菌研究不斷被重視，因此開發(fā)中藥資源對(duì)抗細(xì)菌感染十分重要。傷科藥水是一種基于傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論和臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)制的醫(yī)院制劑，由黃連、梔子、紫草等中藥組成。其具有抗炎消腫、清熱涼血、活血化瘀等作用，臨床主要用于軟組織及骨骼損傷、跌打損傷，在骨傷科應(yīng)用廣泛。前期研究證實(shí)其有良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，且有一定的抗感染作用。本研究通過(guò)開展傷科藥水體外抗菌作用的實(shí)驗(yàn)研究，明確其體外抗菌作用特點(diǎn)，為該制劑的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCMCC 26003)；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureusMRSA3-1007-W1)；糞腸球菌(EnterococcusfaecalisEFA-17001-W1)；鏈球菌(StreptococcusCMCC 32210)；白色念珠菌(CandidaalbicansATCC 10231)；銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa[CMCC(B)10 104])；大腸埃希菌(EscherichiacoliCMCC 44102)均由廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

傷科藥水，由廣東藥科大學(xué)中藥藥理學(xué)系提供；黃連(批號(hào)20181101)，佛山市中天中藥飲片有限公司產(chǎn)品；莫匹羅星軟膏(國(guó)藥準(zhǔn)字H10930064)，中美天津史克制藥有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)：3105222)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：3105730)、LB瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：1074511)均為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；血清(批號(hào)：42G9247K,life technologies)、氯化鈉(批號(hào)20171204-2)，廣州化學(xué)試劑廠。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

SW-CJ-IF單人雙面超凈工作臺(tái)，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；JJ200型電子天平，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；THZ-98A恒溫振蕩器，BWS-27G精密恒溫水槽；LRH系列生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GI54TW全自動(dòng)立式高壓滅菌器，致微(廈門)儀器有限公司；UV2310Ⅱ雙束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司；H1850R醫(yī)用離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

2 方法

2.1 菌液的制備

將裝有各實(shí)驗(yàn)菌的凍存管取出后用37 ℃水浴快速解凍后，吸取少量菌液加入100 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，置恒溫振蕩器中120 r/min、37 ℃的條件下培養(yǎng)24 h。用無(wú)菌生理鹽水沖洗菌板，收集菌液，采用比濁法計(jì)算菌液濃度，用無(wú)菌生理鹽水配制成濃度約為1×107CFU/mL菌液。

2.2 藥物的制備

2.2.1 黃連水煎液 取黃連50 g，加蒸餾水400 mL，浸泡30 min后煎煮，煮沸后文火煎煮30 min，用紗布過(guò)濾后備用。藥渣再加蒸餾水200 mL，二次煎煮30 min，過(guò)濾，合并2次濾液，濃縮至100 mL，得黃連水煎液500 mg/mL，置4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 莫匹羅星水溶液 取莫匹羅星軟膏(含量20 mg/g)6 g，加入無(wú)菌蒸餾水至4 mL，溶解，得30 mg/mL的莫匹羅星溶液，置4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 打孔法測(cè)量抑菌圈試驗(yàn)

以33 g/L質(zhì)量濃度配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂，加入蒸餾水后，高壓滅菌121 ℃ 30 min后得營(yíng)養(yǎng)瓊脂溶液，在每塊培養(yǎng)皿中倒入25 mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂溶液，自然冷卻得營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板。取配制好的細(xì)菌懸液(濃度為1×107CFU/mL)均勻涂布于瓊脂培養(yǎng)基上，每塊瓊脂平板平均分成4份，在每個(gè)區(qū)域中心打完孔后用無(wú)菌針頭挑出培養(yǎng)基。分別取傷科藥水(690 mg/mL)、黃連水提液(500 mg/mL)、莫匹羅星水溶液(30 mg/mL)、無(wú)菌蒸餾水各50 μL，放入對(duì)應(yīng)孔中。將培養(yǎng)皿置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑并記錄。

2.4 瓊脂稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度

通過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)初步確定試驗(yàn)菌MIC在56～35 mg/mL，將滅菌后的傷科藥水與培養(yǎng)基按一定比例混合，使得到的含藥瓊脂濃度分別為55.2 mg/mL、50.6 mg/mL、46 mg/mL、41.4 mg/mL、36.8 mg/mL。吸取5 μL的金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌菌液點(diǎn)種到含藥的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中；吸取5 μL的大腸埃希菌菌液點(diǎn)種于LB培養(yǎng)基；吸取5 μL的鏈球菌菌液點(diǎn)種到含藥的血清培養(yǎng)基中；另取不含藥液的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板空白對(duì)照。將培養(yǎng)基置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后觀察平板長(zhǎng)菌情況，以含藥物濃度最低平板有、無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的濃度為受試菌的抑菌濃度范圍。重復(fù)試驗(yàn)，以藥物最低濃度平板無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)者即為受試菌的最低抑菌濃度(minimun inhibitory concentration，MIC)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 抑菌試驗(yàn)

表1結(jié)果顯示，傷科藥水(690 mg/mL)對(duì)金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、鏈球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌均有抗菌活性，其抑菌圈直徑與無(wú)菌蒸餾水組相應(yīng)的直徑比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但其抗菌效果低于黃連水煎液(500 mg/mL)，略強(qiáng)于莫匹羅星水溶液(30 mg/mL)。其中，傷科藥水作用24 h后對(duì)金黃色葡萄球菌、鏈球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌的抑菌圈直徑，與黃連水煎液、莫匹羅星水溶液各組的抑菌圈直徑比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

3.2 MIC測(cè)定結(jié)果

表2結(jié)果顯示，傷科藥水質(zhì)量濃度為55.2 mg/mL時(shí)，所有供試菌均不能生長(zhǎng)。其中，傷科藥水對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為36.80 mg/mL、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的MIC為35.27 mg/mL、糞腸球菌的MIC為50.60 mg/mL、鏈球菌的MIC為47.35 mg/mL、銅綠假單胞菌的MIC為46.00 mg/mL、大腸埃希菌的MIC為35.27 mg/mL、白色念珠菌的MIC為52.13 mg/mL。提示傷科藥水對(duì)金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌及大腸埃希菌的抑制作用較強(qiáng)。

D/mm

與無(wú)菌蒸餾水比較：aP<0.05； 與黃連水溶液比較：bP<0.05； 與莫匹羅星水溶液比較：cP<0.05； 與傷科藥水比較：dP<0.05。

A.金黃色葡萄球菌； B.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌； C.糞腸球菌； D.鏈球菌； E.銅綠假單胞菌； F.大腸埃希菌； G.白色念珠菌； a.黃連水溶液； b.傷科藥水； c.蒸餾水； d.莫匹羅星水溶液。

圖1抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果圖
Figure1Graph of bacteriostatic circle results

表2 傷科藥水對(duì)7種細(xì)菌的MICTable 2 MIC of Shangke Yaoshui against 7 kinds of bacteria

4 討論

皮膚軟組織感染是臨床上常見(jiàn)的感染性疾病，治療不當(dāng)病情易反復(fù)或誘發(fā)全身癥狀。為了使研究更貼近臨床，本實(shí)驗(yàn)所采用的病菌均為臨床皮膚感染常見(jiàn)菌[6-8]，體外考察傷科藥水抗皮膚軟組織感染的機(jī)制。傷科藥水是一種純中藥醫(yī)院制劑，臨床已證實(shí)具有一定的預(yù)防和治療皮膚軟組織感染作用，作為中藥制劑不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性，在一定程度上彌補(bǔ)了抗菌藥物的不足。該制劑中黃連清熱燥濕、瀉火解毒，梔子清熱利濕、涼血解毒，紫草清熱解毒、涼血活血，而且現(xiàn)代藥理研究證實(shí)這些中藥都有明顯的抗菌作用[9-11]。

本研究發(fā)現(xiàn)傷科藥水對(duì)所有受試菌都有較好的抑制作用，特別是在抑制金黃色葡萄球菌、鏈球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌作用上，效果明顯強(qiáng)于30 mg/mL莫匹羅星水溶液(P<0.05)，說(shuō)明傷科藥水有較好的體外抗菌作用，對(duì)革蘭陽(yáng)、陰性菌及真菌都有一定抑制作用，這種作用可能是該復(fù)方制劑有效防治皮膚軟組織感染的機(jī)制之一。金黃色葡萄球菌是引起皮膚軟組織感染的主要病原菌[12-13]，本研究MIC實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌對(duì)傷科藥水的敏感性較好，在含傷科藥水36.80 mg/mL的培養(yǎng)基就無(wú)法生存，而且傷科藥水對(duì)金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌均有較好的敏感性，可用以治療耐藥菌感染。上述結(jié)果提示傷科藥水作為中藥抗感染藥物應(yīng)用有一定的前景。研究表明在一些慢性感染過(guò)程中和急性感染的后期使用中藥不僅能抗菌消炎，還具有全面的調(diào)理作用[14]。但本研究?jī)H在體外對(duì)傷科藥水的抗菌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，其在體內(nèi)的抗菌效果還有待于進(jìn)一步探究。