林惠燕，孫愛農(nóng)，鄭曉蘭，方育如

廣東省中山市中心血站質(zhì)管科，廣東中山 528403

乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)陽性是感染HBV的標志,是檢查乙型肝炎血清標志物的重要指標之一。HBsAg是HBV的外殼蛋白，它本身不具有傳染性，但它的出現(xiàn)常伴隨HBV的存在[1]。在感染HBV 2～6個月后，大部分人可在血清中測到HBsAg呈反應(yīng)性(俗稱“陽性”)。HBV主要感染亞洲人群[2]，且我國人群HBV感染率相對較高。在無償獻血體檢時，首先HBsAg初篩檢測合格才能進入獻血環(huán)節(jié)，然而HBV的篩選僅限于HBsAg檢測[3]，因此HBsAg膠體金試劑(簡稱乙肝試紙條)在初篩時顯得尤為重要，它能夠在獻血前體檢中有效檢測出HBsAg陽性的獻血者，并能有效控制因HBsAg陽性導(dǎo)致采集的血液報廢，從而降低血液檢測成本和采供血工作人員的職業(yè)暴露風(fēng)險。試劑質(zhì)量的好壞將影響到HBsAg初篩結(jié)果的可靠程度，按照《血站技術(shù)操作規(guī)程2019版》[4]和CNAS-CL39[5]要求，即使試劑生產(chǎn)廠家提供了符合國家相關(guān)標準的說明書和質(zhì)量檢測合格報告,也要建立并執(zhí)行試劑的質(zhì)量抽檢制度，對每次購進的試劑進行質(zhì)量抽檢，驗證產(chǎn)品性能是否真實、有效，保證試驗結(jié)果檢測可靠。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 HBsAg酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑由英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司、珠海麗珠試劑股份有限公司提供；乙肝試紙條由英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司、北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司提供，定義廠家為A試劑、B試劑(不分順序)；水平為4、8、64 IU/mL的HBsAg標準物質(zhì)由北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司提供；所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.1.2標本來源 選取中山市中心血站2018年6月至2019年6月試驗確證為HBsAg陽性獻血者標本40份,試驗確證為陰性的健康獻血者標本10份，其中40份陽性標本獻血者年齡18～55歲、中位年齡34歲，男25例(62.5%)、女15例(37.5%)。

1.1.3陽性對照品 分離并留取經(jīng)兩個廠家HBsAg的ELISA試劑檢測均陽性的獻血者血漿標本，-25 ℃以下低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4陰性對照品 留取經(jīng)兩個廠家HBsAg的ELISA試劑和HBV DNA檢測均陰性的獻血者血漿標本作為陰性對照，同時用來做液體移行速度檢測。

1.1.5全血標本 留取經(jīng)兩廠家HBsAg的ELISA試劑和HBV DNA檢測均陰性獻血者全血標本。

1.2儀器與環(huán)境 檢測儀器使用Tecan RSP全自動加樣儀(瑞士帝肯)、ELISA全自動加樣儀(安圖生物)、BEP Ⅲ全自動免疫分析儀(德國西門子)、Tecan Sunrise日升酶標儀(瑞士帝肯)、HydroSpeed洗板機(瑞士帝肯)、iEMS孵育振蕩器(美國熱電公司)、羅氏COBAS S201核酸檢測分析儀(瑞士羅氏)、Thermo單通道移液器20～200 μL(美國賽默飛世爾)。在恒溫實驗室(室溫22～25 ℃、濕度40%～60%)完成所有試驗。

1.3方法

1.3.1乙肝試紙條的最低檢出限和最佳檢出限 廠家提供水平為4、8、64 IU/mL的HBsAg標準物質(zhì)，其中1、2 IU/mL是使用4 IU/mL的HBsAg標準物質(zhì)加生理鹽水倍比稀釋所配制。分別測定上述兩種不同廠家的乙肝試紙條，按時間5、10、15、30 min觀察試紙條的變化，30 min內(nèi)能檢測出最低結(jié)果定義為最低檢出限，15 min內(nèi)檢測出全部結(jié)果定義為最佳檢出限。

1.3.2移行速度(時間)與血球阻斷率檢測 乙肝試紙條在加樣后立即觀察，加樣后液體移行速度(陽性對照線顯色時間)應(yīng)<3 min，乙肝試紙條的血球阻斷率應(yīng)合格(即本底應(yīng)無明顯變紅)。

1.3.3標準物質(zhì)的ELISA評估 所有HBsAg標準物質(zhì)均用ELISA檢測,選擇最佳S/CO值，以此為標準，從已知HBsAg陽性標本中挑選S/CO值相對應(yīng)的標本。設(shè)置20份陽性標本與廠家最佳檢出限水平標準物質(zhì)進行對比檢測。

1.3.4最佳檢測水平標本的乙肝試紙條檢測 選擇最佳檢測水平(S/CO值)獻血者血漿標本，用不同廠家乙肝試紙條檢測。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1HBsAg標準物質(zhì)乙肝試紙條檢測情況 從檢測時間來看，2 IU/mL為HBsAg最低檢測水平，A試劑在15 min內(nèi)能夠檢測出8例，最遲能在30 min內(nèi)能檢測出所有陽性結(jié)果；B試劑在15 min內(nèi)能夠檢測出7例，30 min內(nèi)能檢測出8例。從結(jié)果上看，不同試劑之間差異不大。4 IU/mL為HBsAg最佳檢測水平，兩家試劑均在15 min內(nèi)檢測出所有陽性結(jié)果。64 IU/mL為高水平標準物質(zhì)，兩家試劑均在5 min內(nèi)檢測出所有陽性結(jié)果，均無后帶現(xiàn)象導(dǎo)致的假陰性結(jié)果出現(xiàn)。結(jié)果見表1。

表1 HBsAg標準物質(zhì)乙肝試紙條檢測情況[n(%)]

表2 液體移行速度(時間)與血球阻斷率

注： -為未檢測。

2.2液體移行速度(時間)與血球阻斷率 選擇5例陰性血漿和全血標本，分別用上述兩個廠家乙肝試紙條檢測，結(jié)果均合格，見表2。

2.3ELISA檢測HBsAg標準物質(zhì)的最佳S/CO值選擇 結(jié)果顯示，不同水平的HBsAg標準物質(zhì)，檢測出不同的S/CO值，見表3。在定性試驗中，應(yīng)該用接近臨界值的標本對試紙條進行靈敏度評估。因此，根據(jù)表1結(jié)果，計算出HBsAg標準物質(zhì)在最佳檢測水平4 IU/mL時ELISA試劑1、2的最佳S/CO檢測限(CV均值±1s)，分別是28.45±2.13和29.08±2.18，綜合考慮定出最佳S/CO值為28.00±2.00。

表3 ELISA檢測HBsAg標準物質(zhì)的最佳S/CO值選擇

注：△表示該試劑盒檢測結(jié)果A值≥3.0，均為強陽性。

2.4獻血者HBsAg兩家ELISA陽性標本與標準物質(zhì)用乙肝試紙條檢測的結(jié)果 根據(jù)ELISA的S/CO結(jié)果，選擇最佳檢出限標本、強陽性標本及4 IU/mL、64 IU/mL水平的標準物質(zhì)各20份，分別使用兩家廠家乙肝試紙條檢測，結(jié)果表明，最佳檢出限標本和4 IU/mL的標準物質(zhì)均能在15 min內(nèi)被檢出，強陽性標本和64 IU/mL的標準物質(zhì)均能夠在5 min內(nèi)被檢出，都沒有出現(xiàn)后帶(假陰性)現(xiàn)象。

2.5開展乙肝試紙條性能驗證前后HBsAg檢測情況 開展乙肝試紙條性能驗證前，2017年無償獻血47 461例，HBsAg陽性292例，陽性率0.62%；開展乙肝試紙條性能驗證后，2018年無償獻血48 889例，HBsAg陽性241例，陽性率0.49%，2018年HBsAg陽性率有了明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.55，P<0.05)。

3 討 論

HBsAg膠體金檢測法(又稱金標法)檢測HBsAg具有操作簡單方便、檢測快、結(jié)果易看并且可行單份標本檢測等優(yōu)點[6],且保存方便。我國現(xiàn)階段HBsAg膠體金檢測為血站獻血者采血前初篩的一項必要手段，因此試劑的質(zhì)量好壞影響著檢測結(jié)果的可靠程度，單位質(zhì)管部門在新進試劑使用前就必須做好每一批試劑的抽檢，檢測合格發(fā)放質(zhì)檢合格報告；檢測不合格，與廠家協(xié)商作退換貨處理。

本次最低檢出限水平(2 IU/mL)與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果(2.0～2.5 IU/mL)[7-8]相差不大,比廠家提供的合格報告的最低檢測量2.5 ng/mL(相當(dāng)于5 IU/mL)更低。2004年，世界衛(wèi)生組織將HBsAg標準物質(zhì)的定值單位從ng/mL改成IU/mL，換算公式1 IU/mL≈0.5 ng/mL。4 IU/mL標準物質(zhì)從HBsAg膠體金檢測結(jié)果上看，處于臨界水平，能較好反映試紙條的靈敏度檢測水平，在規(guī)定時間內(nèi)能檢測出所有結(jié)果。

本研究對這種檢測方法使用不同廠家提供的試紙條檢測后的數(shù)據(jù)進行分析,從表1、3可以看出，兩個廠家不同水平的HBsAg標準物對比，30 min內(nèi)檢測結(jié)果基本一致，在最低檢測限2 IU/mL上，只能檢測出個別結(jié)果，導(dǎo)致抽檢結(jié)果不合格，建議不要使用該水平的標準物質(zhì)作為進貨檢驗標準。使用HBsAg最佳檢出限標本進行驗證，合格結(jié)果也能達到100.0%。由此看來，陽性標本S/CO值在28.00±2.00也能較好驗證出乙肝試紙條水平。高水平標準物質(zhì)64 IU/mL和HBsAg強陽性標本，能在短時間檢測出陽性結(jié)果。

乙肝試紙條滲透速度(即液體移行速度)的快慢對檢測的結(jié)果會有影響，太快會造成假陰性，HBsAg-Ab1-Au還沒來得及與Ab2結(jié)合就超過了檢測線[9]；太慢也會導(dǎo)致假陰性。高水平標準物質(zhì)和強陽性標本中的HBsAg水平過高,遠超過抗原抗體結(jié)合的最大適宜比例，沉淀反應(yīng)也會不明顯,就會出現(xiàn)后帶現(xiàn)象[10]，即假陰性結(jié)果。因此，還要留意高水平(強陽性)質(zhì)控品的結(jié)果。

開展HBsAg膠體金試劑性能驗證后，對獻血者標本進行ELISA檢測仍檢出少量的陽性標本，經(jīng)分析原始數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)大多是弱陽性(S/CO值<20)人群。2018年采取該驗證方法進行進貨驗收后，當(dāng)?shù)孬I血者HBsAg初篩后陽性率有了明顯下降，在此期間曾出現(xiàn)一批乙肝試紙條因檢測結(jié)果不達標而退回廠家，說明每批試劑開展進貨檢驗是有必要的。

按照進貨檢驗要求[4-5]，對于血源篩查的體外診斷試劑盒，必須要有國家食品藥品監(jiān)督管理部門批簽發(fā)報告，其他檢測試劑，以生產(chǎn)廠商出具的出廠檢驗報告為準。當(dāng)需要留取HBsAg陽性標本時，建議選擇S/CO值在28.00±2.00的陽性標本作為驗證使用，陽性標本必須經(jīng)過消毒滅活后裝管冷凍保存，盡量降低檢測人員職業(yè)暴露的風(fēng)險。水平為4 IU/mL的HBsAg標準物質(zhì)和S/CO在28.00±2.00的HBsAg陽性標本均能夠作為乙肝試紙條進貨性能驗證使用。而使用4 IU/mL的HBsAg標準物質(zhì)既沒有職業(yè)暴露風(fēng)險，又解決了HBsAg陽性標本在低溫存儲環(huán)境下反復(fù)凍融導(dǎo)致抗原活性下降的問題，是乙肝試紙條進貨性能驗證的最佳選擇。