羅妙玲，徐韞健，李秋霞

1.廣東省廣州市海珠區(qū)中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510220；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州 510120；3.廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院2015級(jí)，廣東廣州 528240

巨細(xì)胞病毒(CMV)是人類(lèi)皰疹病毒5型，也稱(chēng)細(xì)胞包涵體病毒，屬于皰疹病毒組的DNA病毒。CMV可通過(guò)呼吸道、上消化道或泌尿生殖道的上皮進(jìn)入人體，引起以呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖泌尿系統(tǒng)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主的各系統(tǒng)感染，患者臨床表現(xiàn)從輕微無(wú)癥狀感染到嚴(yán)重缺陷或死亡。絕大多數(shù)感染者沒(méi)有明顯癥狀，但是在嬰幼兒和免疫功能較差的機(jī)體中可引起嚴(yán)重疾病。普通人群感染CMV后一般沒(méi)有癥狀或者癥狀輕微，但CMV肺炎是實(shí)體器官移植最常見(jiàn)的感染性并發(fā)癥。臨床用于預(yù)防和治療CMV感染的藥物主要有更昔洛韋(GCV)、膦甲酸鈉(FOS)、西多福韋(CDV)等，這些藥物通過(guò)與DNA聚合酶競(jìng)爭(zhēng)達(dá)到抑制病毒 DNA 復(fù)制的作用。由于GCV耐藥的突變點(diǎn)經(jīng)常存在一定的密碼子中，80%～85%的UL97基因突變發(fā)生在密碼子460、520以及590～607的密碼子中[1]。在密碼子460(M460 V/L)、520(H520Q)和591～607(A594V，L595S，C603W)中比較容易觀(guān)察到堿基突變和氨基酸的替代現(xiàn)象[2]。本研究擴(kuò)增UL97基因的密碼子400～630，對(duì)序列進(jìn)行突變位點(diǎn)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年6-12月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床送檢懷疑CMV感染的3 629例標(biāo)本，其中男2 334例，女1 295例；包括血漿2 648例，痰482例，纖維支氣管鏡取痰91例，尿液289例，肺泡灌洗液84例，腦脊液1例，咽拭子17例，胸腔積液4例，羊水12例，乳汁1例。

1.2試劑與儀器 ABI 7500熒光定量PCR儀和ABI 9700 PCR儀(美國(guó)賽默飛公司生產(chǎn))；凝膠成像分析系統(tǒng)(珠海黑馬公司生產(chǎn))；人CMV核酸定量檢測(cè)試劑盒(廣州達(dá)安公司生產(chǎn))；核酸提取液(上海凱杰生物公司生產(chǎn))；PCR擴(kuò)增混合物(大連寶生物公司生產(chǎn))；引物(上海生工公司合成)UL97 F:5′-GCT ACC GAC GTG CCT TTT GC-3′ 658 bp，R:5′-ACG CGA CAC GAG GAC ATC TTG-3′。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本篩選 分析CMV感染患者的情況，均具有明顯的CMV肺炎現(xiàn)象，如不明原因的發(fā)熱和咳嗽氣促或呼吸困難，中性粒細(xì)胞數(shù)量減少，血小板數(shù)量減少，以及血清CMV-DNA陽(yáng)性。此類(lèi)患者的標(biāo)本進(jìn)行DNA提取后置于-20 ℃冰箱，使用ABI 7500熒光定量PCR儀檢測(cè)CMV的拷貝數(shù)，陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參考試劑說(shuō)明書(shū)：測(cè)定結(jié)果大于500 copy/mL，除血漿以外的標(biāo)本直接報(bào)告拷貝數(shù)，血漿標(biāo)本測(cè)定結(jié)果應(yīng)乘以4。收集CMV拷貝數(shù)>10 000 copy/mL的標(biāo)本。

1.3.2血漿標(biāo)本提取 于離心管中加入100 μL待測(cè)標(biāo)本和100 μL DNA提取液1充分混勻震蕩，14 000 r/min離心10 min，離心后棄去上清液，加入20 μL DNA提取液2，刮彈溶解沉淀，14 000 r/min離心30 s，置于100 ℃干浴器中干浴10 min，然后以14 000 r/min離心10min，上清液用作PCR模板備用，放置-20 ℃保存。

1.3.3痰、肺泡灌洗液提取 于待測(cè)標(biāo)本中加入3倍體積4%的NaOH溶液，震蕩至液化后吸取1 mL標(biāo)本于離心管中，14 000 r/min離心10 min，棄上清液后加入1 mL滅菌雙蒸水，吹打混勻，14 000 r/min離心7 min，棄上清液加入DNA提取液225 μL，震蕩混勻。14 000 r/min離心30 s，置于100 ℃干浴器中干浴10 min后，14 000 r/min離心10 min，上清液用作PCR模板備用，放置-20 ℃保存。

1.3.4尿液、胸腔積液、腦脊液、羊水和乳汁標(biāo)本提取 不需前處理，吸取1 mL標(biāo)本于離心管中，提取步驟同痰標(biāo)本。

1.3.5PCR擴(kuò)增與測(cè)序 選擇CMV拷貝數(shù)>10 000 copy/mL的標(biāo)本進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為25 μL，體系中含有Taq酶混合物12.5 μL，雙蒸水8.5 μL，前向引物1 μL，后向引物1 μL，DNA模板2 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min加熱裂解，95 ℃ 1 min，57 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 5 min。于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，送上海生工公司測(cè)序，擴(kuò)增產(chǎn)物與 CMV標(biāo)準(zhǔn)毒株AD169序列比對(duì)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同標(biāo)本中CMV-DNA檢測(cè)結(jié)果比較 3 629例CMV-DNA標(biāo)本中，陽(yáng)性標(biāo)本573例，陽(yáng)性率為15.44%。其中血漿標(biāo)本陽(yáng)性率為9.50%；痰標(biāo)本陽(yáng)性率最高，達(dá)43.57%；痰標(biāo)本陽(yáng)性率明顯高于其他標(biāo)本，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CMV拷貝數(shù)>10 000 copy/mL的標(biāo)本共30例，其中血漿6例，痰10例，纖維支氣管鏡取痰3例，尿液9例，肺泡灌洗液2例。見(jiàn)表1。

2.2CMV-DNA陽(yáng)性患者在不同病區(qū)的比較 573例CMV陽(yáng)性患者中， 器官移植后患者感染CMV陽(yáng)性率最高，為25.00%，與呼吸科和血液科相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 不同標(biāo)本中CMV-DNA檢測(cè)結(jié)果比較

注：與痰比較，*P<0.05。

表2 CMV-DNA陽(yáng)性患者在不同病區(qū)的比較

注：與器官移植比較，*P<0.05。

2.3電泳結(jié)果 經(jīng)PCR擴(kuò)增UL97基因，電泳后可見(jiàn)一長(zhǎng)度為638 bp的DNA條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符。見(jiàn)圖1。

2.4UL97基因測(cè)序結(jié)果分析 測(cè)序結(jié)果與CMV標(biāo)準(zhǔn)株AD169序列進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，8例標(biāo)本UL97基因發(fā)生了堿基的突變，均為器官移植患者標(biāo)本，其中有5例為3個(gè)月持續(xù)在其血中發(fā)現(xiàn)高載量的CMV。無(wú)義突變包括1362 C→T、1368 T→C、1575 C→T、1657 T→C、1698 G→A、1737 T→C、1896 C→T、1902 A→G，這些突變并未導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸的改變；1815 C→G、1525 C→T、1781 G→T這3處堿基突變，導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸D605E、P509S、A594V的改變。見(jiàn)表3。

注：M為Marker；1、3、4為標(biāo)本擴(kuò)增條帶；2為陰性對(duì)照。

圖1 UL97基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

表3 8例患者UL97基因突變分析

3 討 論

CMV基因轉(zhuǎn)錄是病毒復(fù)制活躍的標(biāo)志物，在臨床上CMV早期和晚期基因轉(zhuǎn)錄物mRNA的檢測(cè)通常用作CMV活性感染診斷的指標(biāo)。PCR用于CMV感染的檢測(cè)，具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快捷等特點(diǎn)，可作為CMV感染的早期診斷指標(biāo)。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CMV感染，可及時(shí)反映病毒載量，預(yù)測(cè)感染嚴(yán)重程度，在CMV感染診斷中有很好的實(shí)用價(jià)值。近年來(lái)CMV肺炎的發(fā)病率有上升的趨勢(shì)，加之標(biāo)本大部分來(lái)源于呼吸道感染患者，因此本研究中痰標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性率最高。另外，尿液和肺泡灌洗液標(biāo)本陽(yáng)性率均高于血漿標(biāo)本，與有關(guān)報(bào)道[3]相符。

BARADHI等[4]研究發(fā)現(xiàn)CMV耐藥現(xiàn)象在高病毒載量中更易存在，因此，本研究選取的30例標(biāo)本的病毒拷貝數(shù)在10 000 copy/mL以上。由于移植后患者需要應(yīng)用大劑量的免疫抑制劑，因此CMV感染和耐藥情況在實(shí)體器官移植手術(shù)后發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于健康人，CMV感染與移植死亡率升高明顯相關(guān)。實(shí)體器官移植術(shù)后CMV感染因不同移植器官類(lèi)型而不同，在肺移植發(fā)生率最高，之后為心臟移植和肝移植[5]。GCV耐藥表現(xiàn)在臨床上比較常見(jiàn)，當(dāng)藥物的臨床治療效果降低或病毒對(duì)藥物應(yīng)答反應(yīng)較差時(shí)應(yīng)懷疑為耐藥。當(dāng)患者正在接受足量GCV抗病毒治療，病毒載量不下降甚至持續(xù)增加超過(guò)2周時(shí)應(yīng)考慮GCV耐藥。

MEESING等[6]發(fā)現(xiàn)CMV耐藥發(fā)生率與免疫抑制劑的強(qiáng)度有關(guān)，抗淋巴細(xì)胞球蛋白類(lèi)制劑如抗胸腺球蛋白或抗CD3單克隆抗體的使用,使CMV感染的風(fēng)險(xiǎn)增加3～4倍。本研究中A594V突變是在1例心肺聯(lián)合移植的患者中發(fā)現(xiàn)的，這例患者術(shù)后聯(lián)合使用抗胸腺球蛋白與抗病毒藥物。當(dāng)患者體內(nèi)檢測(cè)出CMV復(fù)制后，由于患者伴有不明原因的發(fā)熱和咳嗽氣促，白細(xì)胞數(shù)量減少，血小板數(shù)量減少等疑似CMV肺炎的癥狀，所以臨床用藥改為GCV靜脈滴注，給予足量GCV治療，但CMV病毒載量未下降，反而由原來(lái)的10 500 copy/mL上升至22 600 copy/mL，該現(xiàn)象也符合GCV耐藥現(xiàn)象。此例患者伴有D605E的改變，既往多數(shù)人研究認(rèn)為D605E存在屬于基因多態(tài)性改變，無(wú)論是單一突變還是聯(lián)合突變，其未賦予GCV敏感性的任何變化[7]。但最近也有研究認(rèn)為，如果同時(shí)發(fā)生 A594P/D605E或M460V/D605E聯(lián)合突變，則亦可導(dǎo)致對(duì) GCV耐藥[8]。CHOU等[9]研究發(fā)現(xiàn)A594V突變會(huì)使GCV的最大抑制濃度增加6～9倍，但這種情況并未在上述心肺聯(lián)合移植的患者中出現(xiàn)。本研究中有7例患者均發(fā)生了D605E的變化，這種氨基酸的替代最常見(jiàn)，ZHANG等[10]發(fā)現(xiàn)D605E突變的檢出率在腎移植患者中高達(dá)42.9%。本研究還發(fā)現(xiàn)一種國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道的P509S突變，此例患者并未出現(xiàn)臨床GCV耐藥情況，其突變與GCV耐藥可能沒(méi)有直接作用。