熊翠玲， 陳華枝， 耿四海， 周倪紅， 周丁丁， 祝智威， 陳大福，鄭燕珍， 徐國鈞， 張 曦， 郭 睿

(1. 福建農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)， 福州 350002； 2. 棗莊職業(yè)學(xué)院， 棗莊 277100)

1 引 言

微孢子蟲是一種真菌病原，廣泛感染人類、哺乳類、兩棲類和昆蟲等[1-3].東方蜜蜂微孢子蟲(Nosema ceranae)專性寄生成年蜜蜂的中腸上皮細(xì)胞，由Fries等人于1996年首次在中華蜜蜂(Apis cerana cerana，簡稱中蜂)中發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[4]，隨后該病原迅速傳播蔓延至美國和歐洲地區(qū)，目前已擴(kuò)散到世界各地的西方蜜蜂(Apis mellifera)蜂群[5].被N. ceranae感染的蜜蜂壽命減少1/3[6]，產(chǎn)蜜量降低40%，分泌蜂蠟量減少25%[7]，并伴隨有早熟行為[8].此外，N. ceranae還被認(rèn)為是誘發(fā)蜂群崩潰綜合癥的主要病原之一[9].N. ceranae主要通過糞-口或口-口等途徑在蜜蜂個(gè)體間傳播，當(dāng)孢子進(jìn)入蜜蜂中腸，在堿性環(huán)境的刺激下，孢子發(fā)芽并彈射出高度壓縮的極絲，極絲穿入上皮細(xì)胞并將有感染性的孢質(zhì)原漿注入其中；N. ceranae經(jīng)過增殖形成孢子體，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞裂解，釋放出的成熟孢子繼而感染臨近的細(xì)胞，或者通過糞便排泄到外界環(huán)境中，侵染其他蜜蜂個(gè)體[10].

前人對(duì)于N. ceranae的研究集中在病原鑒定、流行病學(xué)、病理學(xué)、侵染機(jī)理等方面[10-12].Cornman等人于2009年完成N. ceranae的基因組組裝并公布其序列及注釋信息，為其組學(xué)及分子生物學(xué)研究提供了基礎(chǔ).較之蜜蜂，N. ceranae的組學(xué)研究進(jìn)展緩慢，相關(guān)信息較為缺乏.Huang[13]等通過對(duì)N. ceranae感染1-6d的A. mellifera中腸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和分析，發(fā)現(xiàn)在感染過程中宿主的細(xì)胞凋亡基因表達(dá)受到抑制，N. ceranae在一個(gè)繁殖周期中有1 122個(gè)基因差異表達(dá)，并分為4種表達(dá)模式.Evans等發(fā)現(xiàn)1 545個(gè)A. mellifera基因可能受到N. ceranae的5個(gè)miRNA的調(diào)控，這些miRNA聚集成6個(gè)共表達(dá)組，6個(gè)組中的4個(gè)(918個(gè)基因)與至少1個(gè)miRNA的表達(dá)顯著相關(guān)，N. ceranae的miRNA傾向于與病原基因正相關(guān)而與宿主基因負(fù)相關(guān)，表明N. ceranae的miRNA可調(diào)控自身基因表達(dá)也能跨界調(diào)控宿主的部分基因表達(dá)[14].目前，前人僅對(duì)侵染A. mellifera的N. ceranae進(jìn)行了一些組學(xué)研究，而對(duì)于侵染東方蜜蜂(Apis cerana)的N. ceranae以及二者互作，還缺乏相關(guān)研究報(bào)道.近期，筆者團(tuán)隊(duì)結(jié)合鏈特異性建庫方法和RNA-seq技術(shù)對(duì)N. ceranae孢子進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組測序，通過生物信息學(xué)方法分別預(yù)測出83個(gè)長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)和204個(gè)環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)，并對(duì)它們的數(shù)量、種類、結(jié)構(gòu)特征、表達(dá)譜和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了系統(tǒng)的分析和驗(yàn)證[15-16].

A. cerana是N. ceranae的原始寄主，二者經(jīng)過漫長的協(xié)調(diào)進(jìn)化已相互適應(yīng).有研究表明N. ceranae對(duì)A. mellifera具有更強(qiáng)的毒力[5].因此，對(duì)侵染A. cerana的N. ceranae進(jìn)行組學(xué)研究，可為解析N. ceranae的侵染機(jī)制和病原-宿主的適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)制提供有價(jià)值的信息和線索.為了在轉(zhuǎn)錄組水平探究在N. ceranae侵染中蜂過程中的的作用，本研究利用基于鏈特異性建庫方法的RNA-seq技術(shù)對(duì)N. ceranae侵染7 d和10 d的中蜂工蜂中腸進(jìn)行測序，篩選出病原的高表達(dá)基因(highly expressed gene, HEG)，并通過生物信息方法對(duì)N. ceranae的HEG進(jìn)行深入分析，并通過RT-PCR技術(shù)對(duì)部分HEG進(jìn)行驗(yàn)證，以期揭示HEG在N. ceranae侵染中蜂過程的作用，為深入N. ceranae的侵染機(jī)制提供有益的信息和線索.

2 材料與方法

2.1 生物材料

本研究中使用的中蜂取自福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)教學(xué)蜂場；N. ceranae孢子[15]由福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院蜜蜂保護(hù)課題組純化和保存.

2.2 方 法

2.2.1 蜂群選擇 挑選外觀健康、群勢較強(qiáng)的10群中蜂，在每個(gè)蜂箱的巢房門口隨機(jī)抓取6只工蜂，小心拉取中腸，加適量無菌水后充分研磨后取少許研磨液進(jìn)行顯微制片和鏡檢，利用前人報(bào)道的N. ceranae特異性引物(F: CGGCGACGATGTGATATGAAAATATTAA, R: CCCGGTCATTCTCAAACAAAAAACCG)[17]和N. apis特異性引物(F: GGGGGCATGTCTTTGACGTACTATGTA, R: GGGGGGCGTTTAAAATGTGAAACAACTATG)[17]對(duì)鏡檢不到孢子的樣品進(jìn)行PCR檢測，將鏡檢和PCR檢查都為陰性的中蜂蜂群作為本研究的實(shí)驗(yàn)蜂群.

2.2.2 中蜂的飼喂感染及人工飼養(yǎng) 參照郭睿[17]等的方法進(jìn)行中蜂的飼喂接種及人工飼養(yǎng)，簡述如下：將實(shí)驗(yàn)蜂群內(nèi)封蓋子較多的巢脾迅速提至實(shí)驗(yàn)室，放入34±0.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱，將剛出房的工蜂(當(dāng)天記為0 d)放進(jìn)干凈的塑料盒(塑料盒四周打孔通風(fēng)，30只/盒)，每個(gè)盒子上方中心插入一支裝有50%(w/v)無菌糖水的飼喂器；(3)34±0.5 ℃培養(yǎng)24 h，將上述工蜂饑餓處理2 h，然后給每只工蜂飼喂5 μL糖水(含1×106個(gè)N. ceranae孢子)，舍棄未食盡糖水的工蜂，將食盡糖水的工蜂用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；(4)每日檢查工蜂的存活情況，及時(shí)清理死亡的工蜂，每隔24 h更換糖水.本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù).

2.2.3 測序樣品準(zhǔn)備及二代測序 因蜜蜂中腸是N. ceranae寄生和二者互作的主要部位，故本研究選取N. ceranae侵染的中蜂工蜂中腸作為測序材料.分別拉取N. ceranae感染7 d(即8日齡)和10 d(即11日齡)的工蜂中腸，迅速移至RNA free的EP管中，三只中腸并入一管，液氮速凍后轉(zhuǎn)移保存于-80 ℃超低溫冰箱中備用.將侵染中蜂8日齡和11日齡工蜂的N. ceranae分別設(shè)為Nc1和Nc2.Nc1組的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)為：Nc1-1、Nc1-2和Nc1-3；Nc2組的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)為：Nc2-1、Nc2-2、Nc2-3.利用RNAiso Reagent試劑盒(TaKaRa公司，中國)抽提上述樣品的總RNA，再用RNase-free DNase I去除上述樣品中基因組DNA殘留，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇.參照郭睿等[18]的方法構(gòu)建cDNA文庫.建好的文庫委托廣州基迪奧生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙端測序，測序平臺(tái)為Illumina HiSeqTM4000.原始數(shù)據(jù)已上傳NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫，BioProject號(hào)：PRJNA562784.

2.2.4 數(shù)據(jù)質(zhì)控及相關(guān)生物信息學(xué)分析 對(duì)于獲得的原始數(shù)據(jù)讀段(raw reads)，利用Perl腳本去除有adaptors、未知核苷酸比例大于5%和低質(zhì)量的reads，獲得有效讀段(clean reads).按照下述步驟獲得純凈的N. ceranae數(shù)據(jù)：(1)用短reads比對(duì)工具bowtie將clean reads比對(duì)到核糖體數(shù)據(jù)庫(最多允許錯(cuò)配5個(gè))；(2)利用TopHat2軟件將未比對(duì)上的數(shù)據(jù)比對(duì)A. cerana的參考基因組(assembly ACSNU-2.0)以去除宿主本身的clean reads；(3)進(jìn)而利用TopHat2軟件將未比對(duì)上剩余的clean reads繼續(xù)比對(duì)到N. ceranae的參考基因組(assembly ASM98816v1)，比對(duì)上的clean reads即為病原的數(shù)據(jù).進(jìn)一步再利用Cufflinks軟件對(duì)比對(duì)上的clean reads進(jìn)行組裝.

各組基因的表達(dá)量用公式FPKM =Total exon fragment/[Mapped fragment (millions) × exon length (KB)]計(jì)算.利用R包計(jì)算個(gè)樣品之間的相關(guān)性系數(shù).利用OmicShare在線分析工具(http://www.omicshare.com/tools/index.php/Home/Index/index.html)對(duì)各個(gè)樣品的HEG(FPKM >15)進(jìn)行Venn分析，以及對(duì)共有HEG進(jìn)行GO分類和KEGG代謝通路(pathway)富集分析等生物信息學(xué)相關(guān)分析.

2.2.5 HEG的RT-PCR驗(yàn)證 為證明測序數(shù)據(jù)的可靠性，從共有HEG中隨機(jī)選擇8個(gè)進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證.根據(jù)所選HEG的序列信息，使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)特異性引物，委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行引物合成，相關(guān)引物序列信息詳見表1.利用AxyPrepTMMultisource Total RNA Miniprep試劑盒(AXYGEN公司，中國)分別抽提上述受N. ceranae感染的中蜂工蜂中腸樣品的總RNA，作為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括PCR Mixture 10 μL，正、反向引物各1 μL，cDNA模板1 μL，無菌水7 μL.PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃50 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

表1 RT-PCR的引物信息

3 結(jié)果與分析

3.1 測序數(shù)據(jù)概覽

比對(duì)上A. cerana基因組的clean reads數(shù)分別為180 237 114和36 054 033條，Q20和Q30分別在98.41%和95.28%及以上(表2).此外，各組內(nèi)各生物學(xué)重復(fù)之間的Pearson相關(guān)性均在0.969 1及以上(圖1).以上結(jié)果說明本研究中的測序樣品重復(fù)性較好，高通量測序數(shù)據(jù)質(zhì)量好，可滿足本研究中N. ceranae的HEG分析.

表2 測序數(shù)據(jù)的信息統(tǒng)計(jì)

Tab.2 Summary of sequencing data information

樣本Samples比對(duì)上N. ceranae基因組的有效讀段Clean reads mapped to the N. ceranae genome99%堿基正確率/%Q20/%99.9%堿基正確率/%Q30/%Nc1-138 984 05898.7596.30Nc1-235 848 94498.7496.23Nc1-3105 404 11298.6095.85Nc2-17 568 77498.4195.28Nc2-213 016 30398.8096.42Nc2-315 468 95698.6696.02

3.2 HEG的篩選及Venn分析

從Nc1和Nc2中分別篩選出1 482和901個(gè)HEG.共有HEG為890(59.6%)個(gè)，特有HEG分別為592(39.7%)和11(0.7%)個(gè)(圖2).Nc1和Nc2的部分特有HEG信息詳見表3和表4.

圖1 Nc1和Nc2中不同生物學(xué)重復(fù)間的相關(guān)性Fig.1 Pearson correlations between every two biological repeats within Nc1 and Nc2 groups

圖2 Nc1和Nc2中HEG的Venn分析

Fig.2 Venn analysis of HEGs in Nc1 and Nc2 groups

3.3 共有及特有HEG的GO分類

GO分類結(jié)果顯示分別有298、302和175個(gè)共有HEG富集在生物學(xué)進(jìn)程、細(xì)胞組分和分子功能，共涉及24個(gè)功能條目，富集前5位分別是代謝進(jìn)程(230個(gè)HEG)、催化活性(213個(gè)HEG)、結(jié)合(200個(gè)HEG)、細(xì)胞進(jìn)程(198個(gè)HEG)、細(xì)胞(139個(gè)HEG)(圖3).

Nc1的特有HEG涉及21個(gè)功能條目，富集前10位分別是代謝進(jìn)程(67個(gè)HEG)、細(xì)胞進(jìn)程(64個(gè)HEG)、催化活性(63個(gè)HEG)、結(jié)合(61個(gè)HEG)、單組織進(jìn)程(32個(gè)HEG).Nc2的特有HEG涉及4個(gè)功能條目，分別為代謝進(jìn)程(1個(gè)HEG)、細(xì)胞進(jìn)程(1個(gè)HEG)、單組織進(jìn)程(1個(gè)HEG)和催化活性(1個(gè)HEG).

表3 Nc1的前11位特有HEGs

表4 Nc2的特有HEGs

圖3 Nc1和Nc2的共有HEGs的GO分類Fig.3 GO categorization of shared HEGs in Nc1and Nc2 groups

3.4 共有及特有HEG的KEGG代謝通路富集分析

KEGG代謝通路富集分析結(jié)果顯示，共有HEG富集在新陳代謝、遺傳信息加工、環(huán)境信息加工、細(xì)胞組分、有機(jī)體系統(tǒng)等5大類的72條代謝通路，其中富集前10位分別是核糖體(53個(gè)HEG)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工(33個(gè)HEG)、蛋白酶體(27個(gè)HEG)、真核生物的核糖體生物合成(24個(gè)HEG)、嘧啶代謝(23個(gè)HEG)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(21個(gè)HEG)、嘌呤代謝(21個(gè)HEG)(圖4).進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)2個(gè)共有HEG富集在MAPK信號(hào)通路(圖5).

Nc1的特有HEG富集在51條代謝通路，富集前10位分別是泛素介導(dǎo)的蛋白水解(12個(gè)HEG)、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(11個(gè)HEG)、細(xì)胞周期-酵母(11個(gè)HEG)、嘌呤代謝(11個(gè)HEG)、真核生物的核糖體生物合成(11個(gè)HEG).Nc2的特有HEG僅富集在1條代謝通路，即淀粉和蔗糖代謝.

圖4 Nc1和Nc2的共有HEG的KEGG代謝通路分析Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis of shared HEGs in Nc1 and Nc2 groups

圖5 N. ceranae的MAPK信號(hào)通路概貌紅框表示Nc1和Nc2的共有HEF.Fig.5 Overview map of MAPK signaling pathway in N. ceranaeRed boxes indicate the shared HEF between Nc1 and Nc2.

圖6 8個(gè)共有HEG的RT-PCR驗(yàn)證 A:磷酸甘露糖酶編碼基因; B: 假設(shè)蛋白NCER_102326編碼基因; C: RNA聚合酶II CTD磷酸酶編碼基因; D: 水通道樣蛋白編碼基因; E: 26s蛋白酶體調(diào)節(jié)亞基4編碼基因; F: 蛋白酶體亞基-1型編碼基因; G: 蓖麻毒素b凝集素編碼基因; H: 鳥苷酸結(jié)合蛋白sar1編碼基因Fig. 6 RT-PCR verification of eight shared HEGsA:phosphomannomutase encoded gene; B: hypothetical protein NCER_102326 encoded gene; C: RNA polymerase ii ctd phosphatase encoded gene; D: aquaporin-like protein encoded gene; E: 26s proteasome regulatory subunit 4 encoded gene; F: proteasome subunit beta type-1 encoded gene; G: ricin b lectin encoded gene; H: gtp-binding protein sar1 encoded gene

3.5 HEG的RT-PCR驗(yàn)證

電泳結(jié)果顯示8個(gè)隨機(jī)挑選的共有HEG在Nc1和Nc2中均擴(kuò)增出目的條帶(圖6)，初步證實(shí)了本研究預(yù)測的HEG真實(shí)存在.

4 討論與結(jié)論

N.ceranae廣泛感染世界各地的蜂群，除能對(duì)蜜蜂造成能量脅迫和免疫抑制等影響外，還能與其他生物或非生物脅迫因子共同危害蜜蜂健康[6-8].此前的組學(xué)相關(guān)研究主要集中在N. ceranae與A. mellifera的互作方面，有關(guān)N. ceranae與A. cerana互作的組學(xué)研究鮮有報(bào)道.為探究N. ceranae在侵染中蜂過程的HEG表達(dá)譜及功能，本研究利用RNA-seq技術(shù)對(duì)N. ceranae侵染7 d和10 d的中蜂工蜂中腸進(jìn)行測序，得到高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)，并通過連續(xù)比對(duì)A. cerana和N. ceranae的基因組獲得病原本身的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù).從Nc1和Nc2中分別篩選出1 482和901個(gè)HEG，其中有890個(gè)在二者中皆高量表達(dá)(FPKM分別介于72 073.050-15.76和75 951.357-15.737)，分別有592個(gè)HEG(FPKM介于2 962.700-15.003)和11個(gè)HEG(FPKM介于51.873-16.387)特異性高量表達(dá).推測上述共有HEG在N. ceranae的侵染過程發(fā)揮基礎(chǔ)性作用，而特有HEG在侵染的不同階段具有特定功能，但具體的功能有待進(jìn)一步研究.Cornman等曾利用羅氏454平臺(tái)對(duì)N. ceranae孢子進(jìn)行測序，通過相關(guān)生物信息學(xué)軟件對(duì)基因組進(jìn)行了組裝和注釋[19].然而，由于缺失基因功能研究技術(shù)體系，包括N. ceranae在內(nèi)的微孢子蟲的轉(zhuǎn)基因操作技術(shù)尚未完全建立，僅在家蠶微孢子蟲中有過一例轉(zhuǎn)基因研究報(bào)道[20]，因而，包括N. ceranae在內(nèi)的微孢子蟲的基因功能研究近乎停滯，加上N. ceranae的組學(xué)數(shù)據(jù)相對(duì)有限，導(dǎo)致其基因功能注釋信息較不完善.本研究發(fā)現(xiàn)，Nc1和Nc2的HEG共包含362個(gè)假定蛋白編碼基因，這些HEG在各大主流蛋白功能數(shù)據(jù)庫尚缺乏功能注釋信息，其完善需要更多的組學(xué)數(shù)據(jù)的支持以及轉(zhuǎn)基因操作技術(shù)體系的建立.

本研究中，Nc1和Nc2的共有HEG涉及24個(gè)功能條目；分別有139、139、64、34、30和17個(gè)HEG富集在細(xì)胞、細(xì)胞組件、細(xì)胞器、細(xì)胞膜、細(xì)胞膜組件和細(xì)胞器組件，另有198和27個(gè)HEG富集在細(xì)胞進(jìn)程和細(xì)胞組分組織或生物合成，表明N. ceranae在侵染中蜂的過程中伴隨著活躍的細(xì)胞生命活動(dòng)，以促進(jìn)自身在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖.此外，上述共有HEG參與了72條代謝通路，包含碳代謝(15)和糖酵解/糖異生(11)等41條物質(zhì)代謝通路，氧化磷酸化(8)和磷酸戊糖途徑(5)2條能量代謝通路.上述結(jié)果表明N. ceranae在侵染過程中的物質(zhì)和能量代謝較為旺盛.Ponton等[21]的發(fā)現(xiàn)N. ceranae侵染A. mellifera后即利用宿主的物質(zhì)和能量進(jìn)行自身遺傳物質(zhì)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯.本研究發(fā)現(xiàn)分別有23、21和21個(gè)N. ceranae的HEG富集在嘧啶代謝、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和嘌呤代謝；此外，分別有53、33和19個(gè)HEG富集在核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工和氨?；?tRNA生物合成.這些結(jié)果表明N. ceranae在中蜂工蜂中腸上皮細(xì)胞內(nèi)的增殖過程中同時(shí)進(jìn)行著較為活躍的DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯等活動(dòng).

信號(hào)通路指能將細(xì)胞外的信號(hào)經(jīng)細(xì)胞膜傳入細(xì)胞內(nèi)的一系列酶促反應(yīng)通路，真菌通過MAPK等信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對(duì)外界環(huán)境的變化作出相應(yīng)的應(yīng)答，進(jìn)而對(duì)生長和毒力等相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而影響孢子形成、營養(yǎng)感知和形態(tài)建成等生物學(xué)過程[22].陳大福等[23]發(fā)現(xiàn)對(duì)于侵染中蜂6日齡幼蟲的蜜蜂球囊菌(Ascopshaera apis，簡稱球囊菌)，富集在MAPK信號(hào)通路的HEG遠(yuǎn)多于體外培養(yǎng)的球囊菌，推測MAPK信號(hào)通路在球囊菌的侵染過程作用關(guān)鍵.本研究中，2個(gè)共有HEG富集在MAPK信號(hào)通路，暗示此信號(hào)通路在N. ceranae的侵染過程中發(fā)揮重要作用.Jaroenlak等[24]在蝦肝腸微孢子蟲(Enterocytozoon hepatopenaei)中發(fā)現(xiàn)一種分布在內(nèi)生孢子和外孢子層的新孢壁蛋白(EhSWP1)，作為病原在侵染早期的重要毒力因子，可能通過結(jié)合肝素附著到宿主細(xì)胞表面.極管蛋白與N. ceranae毒力大小有關(guān)，有研究表明干擾N. ceranae的極性管蛋白3基因(ptp3)可抑制N. ceranae增殖[25].Paldi等發(fā)現(xiàn)宿主攝入靶向N. ceranae的ADP/ATP轉(zhuǎn)移蛋白基因的siRNA能導(dǎo)致特定的基因沉默，進(jìn)而會(huì)影響N. ceranae感染水平和宿主的生理狀況[26].本研究中，孢壁蛋白基因(XM_002996303.1, Nc1中FPKM=24 434.550, Nc2中FPKM=33 275.467)、極管蛋白基因(XM_002995446.1, Nc1中FPKM=17 490.823, Nc2中FPKM=29 944.273)、蓖麻毒素B鏈基因(XM_002995387.1, Nc1中FPKM=698.757, Nc2中FPKM=1 547.050)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體基因(XM_002995069.1，Nc1中FPKM=133.697, Nc2中FPKM=265.673)、ATP/ADP轉(zhuǎn)移酶基因(XM_002995682.1，Nc1中FPKM=10 832.593, Nc2中FPKM=7 752.717)和絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶基因(XM_002995071.1, Nc1中FPKM=337.033, Nc2中FPKM=266.083)等毒力基因均為高量表達(dá)，表明N. ceranae在其侵染中蜂工蜂的過程中通過維持上述毒力基因的高表達(dá)水平以提升毒力蛋白的合成代謝，進(jìn)而促進(jìn)自身在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖.海藻糖廣泛存在于酵母等真菌的孢子和子實(shí)體中，在脫水、干旱、高溫、冷凍、高滲透壓和有毒試劑等不良環(huán)境的脅迫下起到保護(hù)作用[27].海藻糖與海藻糖酶結(jié)合會(huì)產(chǎn)生大量葡萄糖，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高促進(jìn)微孢子蟲對(duì)宿主的侵染，在微孢子蟲孢子的發(fā)芽過程中海藻糖酶催化海藻糖水解為葡萄糖為孢子正常發(fā)育提供能量[28].本研究發(fā)現(xiàn)，海藻糖磷酸合酶1基因(XM_002996572.1, Nc1中FPKM=239.363, Nc2中FPKM=301.7)和海藻糖-6-磷酸合酶基因(XM_002996577.1, Nc1中FPKM=73.413, Nc2中FPKM=200.397)在Nc1和Nc2中皆高量表達(dá)，推測N. ceranae通過調(diào)控海藻糖磷酸合酶合成速率為自身增殖提供能量.筆者團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)于N. ceranae侵染7d和10d的中蜂工蜂中腸，隨著侵染時(shí)間的延長，與宿主物質(zhì)和能量代謝相關(guān)的HEG數(shù)量持續(xù)降低[29]，表明宿主的物質(zhì)和能量代謝受到N. ceranae的抑制，體現(xiàn)出N. ceranae通過與中蜂互作而對(duì)后者的部分生命活動(dòng)進(jìn)行操縱.前人研究發(fā)現(xiàn)通過RNA干擾(RNAi)對(duì)N. ceranae的ATP/ADP轉(zhuǎn)移酶和裸角質(zhì)層(Naked cuticle)等毒力因子基因進(jìn)行沉默的效果良好[26, 30].未來可針對(duì)N. ceranae的海藻糖磷酸合酶1基因和海藻糖-6-磷酸合酶基因設(shè)計(jì)特異性的小干擾RNA(siRNA)，通過注射或飼喂感染蜜蜂對(duì)該上述病原基因進(jìn)行沉默，有望用于蜜蜂微孢子蟲病的治療.值得一提的是，本研究發(fā)現(xiàn)若干表達(dá)水平相對(duì)特別高的基因，如部分SR22蛋白基因(XM_002996758.1, Nc1中FPKM=61 410.717, Nc2中FPKM=75 951.357)、假定蛋白NCER_100570基因(XM_002996307.1, Nc1中FPKM=69 904.740, Nc2中FPKM=75 053.357)和延伸因子1基因(XM_002995284.1, Nc1中FPKM=33 358.027, Nc2中FPKM=34 716.303)，下一步擬通過RT-PCR和RACE技術(shù)得到上述HEG的cDNA全長序列，進(jìn)而在核酸和蛋白水平開展相關(guān)的功能研究.

綜上所述，N. ceranae可能通過MAPK信號(hào)通路對(duì)中蜂中腸的堿性環(huán)境作出應(yīng)答，促進(jìn)孢壁蛋白、極管蛋白、蓖麻毒素B鏈、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體、ADP/ATP轉(zhuǎn)移蛋白和絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶等毒力因子基因的高量表達(dá)，刺激孢子萌發(fā)和菌絲彈射，促進(jìn)N. ceranae對(duì)中蜂中腸上皮細(xì)胞的侵染；在中蜂中腸細(xì)胞內(nèi)，激活A(yù)DP/ATP轉(zhuǎn)移蛋白和海藻糖磷酸合酶基因的表達(dá)，對(duì)宿主造成能量脅迫，為自身增殖提供能量.本研究通過深入分析侵染中蜂工蜂的N. ceranae的HEG表達(dá)譜，揭示了HEG在病原侵染過程中的潛在作用，揭示N. ceranae通過維持孢壁蛋白、極管蛋白、蓖麻毒素B鏈、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體、ADP/ATP轉(zhuǎn)移蛋白和絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶等毒力因子基因，以及ATP/ADP轉(zhuǎn)移酶、海藻糖磷酸合酶1和海藻糖-6-磷酸合酶等能量代謝相關(guān)蛋白編碼基因的高量表達(dá)，促進(jìn)自身在中蜂工蜂中腸的侵染過程.研究結(jié)果為明確N. ceranae對(duì)中蜂的侵染機(jī)制提供了有益信息和線索.