鐘 嬋，張 濤，黃李冰雪，劉 暢，孫艷珍，黃曉燕，陳遠(yuǎn)能?

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧530000； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 南寧530000；3.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧530000）

胃癌仍然是全球癌癥死亡的主要原因之一，屬亞洲地區(qū)分布最廣［1］。胃癌的病理發(fā)生機(jī)制頗為復(fù)雜，受多因素、多基因的影響，而幽門螺桿菌已被公認(rèn)為致癌的關(guān)鍵因子［2］，近幾年已被成為研究防治胃癌的重要靶點(diǎn)。非可控性炎癥使胃黏膜發(fā)生癌變成為必然趨勢，因此探討幽門螺桿菌感染相關(guān)胃癌中炎癥介質(zhì)、腫瘤壞死因子的表達(dá)情況尤為重要。以中醫(yī)藥理論指導(dǎo)為基礎(chǔ)，前期課題組臨床研究觀察清熱化濕方能減輕炎癥反應(yīng)，明顯緩解幽門螺桿菌感染相關(guān)胃癌的作用反應(yīng)。為進(jìn)一步觀察其防治胃癌的可能機(jī)制，課題組開展清熱化濕方對幽門螺桿菌相關(guān)胃癌中TNF-α、IL-8 及TLR-4 表達(dá)研究。

1 材料

1.1 動(dòng)物及菌株 SPF 級雄性BALB／c 小鼠90 只，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號SCXK （湘）2001-0003，合格證號0060892，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號SCXK （桂） 2010-0001。幽門螺桿菌悉尼菌株SS1 系南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。大鼠組織取材于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器與試劑 哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)（批號CM911）、無菌脫纖維綿羊血（北京索萊寶科技有限公司）；N-甲基-N-亞硝基脲 （MNU，美國Sigma 公司，批號N136701）；Anti-TLR4 antibody （批號AB13556）、Anti-TNF-α antibody（批號AB6671），均購自英國Abcam 公司；IL-8 antibody（批號38419，美國Sab 公司）；RM2135 切片機(jī)（德國徠卡公司）；倒置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；離心機(jī)、BCA 蛋白定量試劑盒（北京華肽先鋒生物科技有限公司）。

1.3 藥物 清熱化濕方（藿香6 g，川厚樸3 g，姜半夏4.5 g，赤茯苓9 g，杏仁9 g，生薏 苡仁12 g，白豆蔻1.8 g，豬茯苓4.5 g，淡豆豉9 g，澤瀉4.5 g，黃連12 g，梔子12 g） 購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院仁愛分院。上述藥材用蒸餾水煎成藥液，濃縮，配制成1 g 生藥／1 mL藥液，過濾分裝4 ℃冰箱保存。蘭索拉唑腸溶膠囊（批號H20065186，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，15 mg）；阿莫西林膠囊 （批 號 H44021351，珠海聯(lián) 邦制藥 有限公 司，250 mg）；克拉霉素（批號H20031041，江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司，500 mg）。

2 方法

2.1 幽門螺桿菌培養(yǎng) 將幽門螺桿菌悉尼菌株SS1 系復(fù)蘇后，接種于7%瓊脂羊血培養(yǎng)基中，37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱，在厭氧條件下培養(yǎng)48 h，可見菌落長出，將菌落刮下溶于布氏肉湯，制成幽門螺桿菌菌液，紫外分光光度計(jì)測濃度，幽門螺桿菌菌液為109CFU／mL。經(jīng)快速尿素酶試驗(yàn)證實(shí)幽門螺桿菌培養(yǎng)成功。

2.2 模型制備 參照文獻(xiàn)［3］ 將適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周的90 只健康BALB／c 小鼠，隨機(jī)分成6 組，正常組、模型組、清熱化濕方組（低、中、高劑量）、陽性對照組（抗幽門螺桿菌三聯(lián)藥）。除正常組外，剩余各組均予小鼠幽門螺桿菌菌液0.8 mL 灌胃，隔天1 次，共5 次。待幽門螺桿菌定植成功后開始進(jìn)行分組干預(yù)，不同劑量清熱化濕方組的小鼠分別按低、中、高（2.71、5.43、10.86 g／kg） 劑量灌胃，1 d／次，持續(xù)28 周；陽性對照組（蘭索拉唑腸溶膠囊+克拉霉素+阿莫西林） 的小鼠按成人用藥的6 倍給藥灌胃。同時(shí)予干預(yù)組小鼠MNU 懸液 ［MNU-水 （5 mg ∶3 mL）］ 0.3 mL 灌胃，每周1 次，持續(xù)10 周；并注意觀察各小鼠一般情況。末次給藥后處死全部小鼠，沿胃小彎縱軸將胃組織分為兩半，一半做快速尿素酶試驗(yàn)，另一半置于10%中性甲醛、電鏡固定液中備測。

2.3 小鼠胃組織形態(tài)學(xué)改變及超微結(jié)構(gòu)變化 常規(guī)HE 染色，光鏡下觀察炎癥和癌變情況；使用醋酸鈾染色，透射電鏡下觀察小鼠胃黏膜超微結(jié)構(gòu)變化。

2.4 RT-PCR 檢測胃黏膜IL-8、TLR-4 及TNF-αmRNA 表達(dá) 以β-actin為內(nèi)參，檢測胃黏膜IL-8、TLR-4 及TNF-αmRNA 表達(dá)，采用TRIzol 法提取RNA，然后取2 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，將逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 稀釋10 倍，作為模板進(jìn)行PCR 檢測。反應(yīng)條件為95 ℃120 s～95 ℃5 s～60 ℃30 s，35～40 循環(huán)。以目的基因與內(nèi)參的mRNA 表達(dá)比值作為目的基因的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

2.5 Western blot 檢測胃黏膜IL-8、TLR-4 及TNF-α 蛋白表達(dá) 以GADPH 抗體為內(nèi)參，檢測胃黏膜IL-8、TLR-4 及TNF-α 蛋白表達(dá)，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描，以特異性條帶濃度與面積的乘積為有效值，反映蛋白表達(dá)水平。具體步驟為蛋白制備，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉、抗原抗體反應(yīng)，顯色、檢測分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法 用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（） 表示，符合正態(tài)分布，采用方差分析；等級資料采用秩和檢驗(yàn)。以P≤0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般情況 造模第13 周開始，模型組部分小鼠出現(xiàn)精神差、食欲不振、毛發(fā)脫落、慵懶嗜睡等現(xiàn)象，有4 只小鼠死亡；正常組小鼠一般情況尚可；清熱化濕方組、陽性對照組中各有2 只小鼠死亡。經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)，模型組部分死亡的小鼠腹腔臟器有穿孔、粘連、局部黑變等現(xiàn)象。

3.2 光鏡下各組小鼠胃黏膜組織病理學(xué)變化 圖1 可見光鏡下正常組無改變；小鼠胃癌造模成功率約70%，模型組癌變率占66.67%，模型組符合中分化腺癌改變；藥物干預(yù)后，清熱化濕方組散在潰瘍改變，未見異型細(xì)胞。陽性對照組炎性細(xì)胞浸潤，符合潰瘍改變，可見少許異型細(xì)胞。

3.3 吉姆薩染色檢測各組小鼠幽門螺桿菌感染情況 圖2可見正常組無幽門螺桿菌感染；模型組、陽性對照組、清熱化濕方組胃黏膜細(xì)胞核呈藍(lán)色或紫色，胞漿呈粉紅色，幽門螺桿菌呈平滑的淡藍(lán)色至藍(lán)色，彎曲狀或弧形，菌體清楚，主要分布在胃黏膜及胃小凹表面，呈單個(gè)散在、片灶狀或成團(tuán)聚集，組織背景清晰，胃黏膜病變易見。提示模型組、陽性對照組、清熱化濕方組幽門螺桿菌定植成功。

3.4 各組電鏡下小鼠胃黏膜超微結(jié)構(gòu)變化 圖3 可知正常組無明顯改變；模型組細(xì)胞間隙連接結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，癌細(xì)胞散在于間質(zhì)中；清熱化濕組細(xì)胞間隙連接結(jié)構(gòu)破壞，分化較差的上皮細(xì)胞和腸化生細(xì)胞核質(zhì)比大于1，見少許凋亡小體。陽性對照組細(xì)胞間隙連接結(jié)構(gòu)破壞，分化較差，見少許凋亡小體。

圖1 光鏡下各組小鼠胃黏膜組織病理學(xué)變化

圖2 吉姆薩染色檢測各組小鼠幽門螺桿菌感染情況（×40）

3.5 各組小鼠胃黏膜IL-8、TLR-4、TNF-α 蛋白表達(dá) 與正常組比較，模型組IL-8、TLR-4、TNF-α 表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，清熱化濕方組IL-8、TLR-4、TNF-α 表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3.6 各組小 鼠胃黏 膜IL-8、TLR-4、TNF-α mRNA 表達(dá) 與正常組比較，模型組IL-8、TLR-4、TNF-α 表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，清熱化濕方組IL-8、TLR-4、TNF-α 表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

4 討論

以中醫(yī)理念探討胃癌病機(jī)，祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，飲食不節(jié)，情志失調(diào)，脾胃受損，運(yùn)化升降失常，使氣結(jié)痰凝，瘀停熱蘊(yùn)，氣、痰、瘀、毒互結(jié)胃腑而成。中醫(yī)胃癌治則始終以保護(hù)脾胃正氣，推動(dòng)其運(yùn)化生氣血，條達(dá)升降之職。課題組以清熱化濕、健脾和胃的治則，選擇清熱化濕方探討該方防治胃癌的相關(guān)機(jī)制；方中淡豆豉、藿香芳香透表濕，開郁陽氣；藿香、白蔻仁、厚樸芳香化濕，佐半夏行運(yùn)脾化濕之功；杏仁開泄肺氣于上焦，肺氣宣降，水道自調(diào)，而治濕宜利小便，水道通調(diào)，則濕有去路，故茯苓、豬苓、澤瀉、薏苡仁相伍通滲下焦。黃連擅清中焦?jié)駸嶂埃瑮d子清三焦之火。諸藥合用，宣化表里濕熱，通調(diào)上、中、下三焦，奏清熱化濕、健脾和胃功效［4-7］。

圖3 各組小鼠電鏡下胃黏膜超微結(jié)構(gòu)變化（×12 000）

圖4 各組小鼠胃黏膜IL-8、TLR-4、TNF-α 蛋白表達(dá)

圖5 各組小鼠胃黏膜IL-8、 TLR-4、 TNF-α mRNA 表達(dá)

研究報(bào)道，幽門螺桿菌感染參與了胃癌的演變過程［8］，幽門螺桿菌可刺激胃上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，如IL-8、TNF-α 等，而幽門螺桿菌要啟動(dòng)炎癥因子必須借助TLR-4 受體，該受體參與識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁中的脂多糖（LPS），幾乎所有的TLRs 都能激活MyD88 依賴性的通路而誘發(fā)炎癥反應(yīng)，而有相關(guān)報(bào)道說明，在MiR-155 的多個(gè)靶點(diǎn)中，MyD88 被認(rèn)為是IL-8 調(diào)控的靶點(diǎn)，MiR-155 可能通過抑制翻譯而下調(diào)蛋白MyD88 的表達(dá)進(jìn)而降低IL-8 的產(chǎn)生［9-10］。經(jīng)研究表明，幽門螺桿菌感染可促進(jìn)IL-8 在胃黏膜中過度表達(dá)，且IL-8 的高表達(dá)與胃癌預(yù)后不良呈直接相關(guān)［11］。相關(guān)研究表明IL-8 rs4073 多態(tài)性可能作為亞洲人胃癌的遺傳生物標(biāo)記物［12］。相關(guān)Meta 分析表明，TNF-α基因多態(tài)性與胃癌風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，尤其是對亞洲人而言［13］。據(jù)研究表明，TNF-α-85 7C／T、IL-8-845 T／C 功能多態(tài)性均可明顯增加胃癌或慢性胃炎的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，還觀察到多態(tài)性C 等位基因攜帶者的IL-8 基因表達(dá)水平顯著增高［14］。研究發(fā)現(xiàn)，TLR-4 中的rs4986790 和rs4986791 多態(tài)性可以作為預(yù)測幽門螺桿菌誘發(fā)胃癌風(fēng)險(xiǎn)的遺傳標(biāo)記［15］。這進(jìn)一步闡明IL-8、TLR-4、TNF-α 均參與誘導(dǎo)炎癥免疫，且在胃癌的進(jìn)展中起重要作用。由此說明，由慢性胃炎發(fā)展至胃癌過程中，必須在幽門螺桿菌感染基礎(chǔ)上通過介導(dǎo)TLR-4 信號通路激活下游靶基因MyD88，使AP-1 轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生核易位進(jìn)而調(diào)節(jié)IL-8，此時(shí)TNF-α 也加速了炎癥反應(yīng)進(jìn)程。本研究發(fā)現(xiàn)，清熱化濕方干預(yù)MNU 聯(lián)合幽門螺桿菌感染小鼠后，其胃黏膜組織IL-8、TNF-α 及TLR-4 蛋白和mRNA 表達(dá)均呈下降趨勢，提示清熱化濕類方藥可以調(diào)控IL-8、TNF-α、TLR-4 表達(dá)，發(fā)揮防治胃癌的效應(yīng)?；诒緦?shí)驗(yàn)結(jié)果，下一步可以從胃癌的靶向分子治療角度，篩選出與TLR-4 信號通路密切相關(guān)靶基因，擬采用分子生物技術(shù)調(diào)控該靶基因下游相關(guān)蛋白，并檢測相關(guān)指標(biāo)表達(dá)。同時(shí)結(jié)合清熱化濕方藥進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步揭示清熱化濕類方藥干預(yù)胃癌的作用機(jī)理與有效靶點(diǎn)，開拓中醫(yī)藥防治胃癌的新領(lǐng)域。