鞏園園，毛志海，王奕芳，夏 瑛，陳茂彬，方尚玲

（1.湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北武漢 430068；2.湖北省釀造工藝與裝備工程技術(shù)中心，湖北武漢 430068；3.湖北華信制藥有限公司，湖北咸寧 437400）

中國黃酒作為一種傳統(tǒng)的發(fā)酵酒精飲料，在世界各地已經(jīng)有很長的飲用歷史，其晶瑩剔透的色澤，幽雅馥郁的芳香以及醇厚留香的口感廣受消費者的喜愛。隨著生活水平的提高，人們對黃酒的品質(zhì)要求更高，生產(chǎn)出酒質(zhì)更好的黃酒是必然趨勢[1]。酵母是黃酒生產(chǎn)的靈魂，酵母發(fā)酵性能的優(yōu)劣很大程度上決定著酒精發(fā)酵質(zhì)量的好壞，直接影響到酒精生產(chǎn)的成本，也在一定程度上反映了酒精企業(yè)的生產(chǎn)技術(shù)水平[2]。

在黃酒釀造過程中，隨著發(fā)酵的進行，酵母生長環(huán)境溫度升高，pH 值偏低，滲透壓增大，乙醇濃度增高，這些環(huán)境都會影響酵母的生長和發(fā)酵性能。有研究表明，通過改變酵母發(fā)酵劑的組合可調(diào)節(jié)黃酒的風味特征[3]。由此可見，選擇性能優(yōu)異的酵母，以提高黃酒風味和品質(zhì)是企業(yè)必然的選擇。

本文從各種酒曲中分離純化的13 株酵母進一步篩選得到3 株發(fā)酵性能較好，產(chǎn)風味物質(zhì)含量較高的酵母，分別命名為Y-3、Y-7、Y-10。將3 株酵母進行酒精、溫度、滲透壓、pH 值的耐受性比較，得到1株適用于黃酒釀造的優(yōu)勢菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

由孝感、紹興酒曲中分離純化獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基制備

孟加拉紅富集培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀1 g、無水硫酸鎂0.5 g、瓊脂20 g、孟加拉紅0.033 g、氯霉素0.1 g、水1000 mL。

YEPD 液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、酵母浸粉10 g、瓊脂20 g、水1000 mL。

葡萄糖酒精發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖200 g、尿素5 g、氯化鈣0.55 g、胰蛋白胨10 g、磷酸二氫鉀1 g、酵母粉6 g、水合硫酸鎂1.5 g，水1000 mL。

初篩培養(yǎng)基（TTC 法）：TTC 上層培養(yǎng)基：TTC 0.05 g，葡萄糖0.5 g，瓊脂1.5 g，蒸餾水100 mL，15 ℃滅菌20 min。培養(yǎng)基滅菌后，冷卻至50～60 ℃左右時，搖勻后，立即傾倒于底層平板上。TTC 下層培養(yǎng)基（YPD 固體培養(yǎng)基）：葡萄糖2 g，蛋白胨2 g，酵母膏1 g，瓊脂2 g，蒸餾水100 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌的分離純化

為了從各種酒曲中篩選出純的酵母菌。將酒曲接種至YEPD 液體培養(yǎng)基中，以30 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h，將菌液稀釋106倍，涂布到孟加拉紅酵母富集培養(yǎng)基中，挑取具有典型酵母菌特征的單菌落進行美蘭染色法鏡檢，將符合酵母細胞形態(tài)的菌落，用接種環(huán)接種到Y(jié)EPD 試管斜面中，30 ℃培養(yǎng)48 h，傳代培養(yǎng)三代，得到13 株純化的性狀穩(wěn)定的酵母，分別命名為Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5、Y-6、Y-7、Y-8、Y-9、Y-10、Y-11、Y-12、Y-13。

（1）酵母的TTC 法初篩：TTC 是(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)一種顯色劑，它能對酵母的代謝產(chǎn)物發(fā)生呈色反應(yīng)，通過它可以判斷酵母的酶活力的大小，即酵母發(fā)酵產(chǎn)酒精能力的高低[4]。在一定的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的酵母菌落上覆蓋一層TTC 顯色劑,TTC 會顯示不同的顏色,產(chǎn)酒精能力強的酵母會顯現(xiàn)深紅色,次之顯粉紅色,微紅色的或不顯色的為野生酵母[5]。

取13 株酵母，用稀釋涂布平板稀釋法稀釋到濃度梯度為10-5，接種于TTC 法的下層培養(yǎng)基平板上，于30 ℃下培養(yǎng)48 h，待菌落長至1～2 mm，將溫度已降至45～50 ℃的一定量上層培養(yǎng)基覆在下層培養(yǎng)基上。于30 ℃無光條件下培養(yǎng)2～4 h 后，取出立即觀察呈色狀況，根據(jù)菌落呈色情況挑選紅色菌株轉(zhuǎn)接至試管斜面上[6]。

（2）酵母菌的復(fù)篩：分別接種13 株酵母菌于100 mL YPED 液體培養(yǎng)基，以180 r/min、30 ℃培養(yǎng)24 h，取2 mL（接種量2%）接入到150 mL的葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中30 ℃、180 r/min 單菌發(fā)酵培養(yǎng)6 h后，置于30 ℃下進行恒溫厭氧發(fā)酵,發(fā)酵72 h 后，取100 mL 發(fā)酵液，加入100 mL 蒸餾水，蒸出蒸餾液100 mL,用酒精計測定酒精含量。將蒸餾液中加入50 mL 無水乙醇，取樣品定容至10 mL 容量瓶，加入內(nèi)標100 μL 乙酸正戊酯，取0.1 μL 進行氣相色譜分析。

1.2.2 酵母耐受性能的測定

酵母是乙醇生產(chǎn)中最常用的發(fā)酵菌株，但是酵母菌耐受性往往成為限制酒類酒精含量和酒質(zhì)好壞的重要因素。因此研究酵母菌株的耐受性對于提高酒質(zhì)有重要的意義[7]。

1.2.2.1 酵母耐受乙醇能力的測定

制備100 mL YEPD 液體培養(yǎng)基，118 ℃滅菌20 min 后加入不同含量的無水乙醇（v/v），含量分別為0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%。接種Y-3、Y-7、Y-10 菌株于不同酒精含量的YEPD 培養(yǎng)基以30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)72 h 后用血球計數(shù)板計數(shù)測定酵母菌落數(shù)。根據(jù)其酵母菌落數(shù)測定其乙醇耐受性。

1.2.2.2 酵母耐受pH值能力的測定

制備100 mL YEPD 培養(yǎng)液，用硫酸調(diào)節(jié)pH 值為1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5，滅菌后接種培養(yǎng)計數(shù)。

1.2.2.3 酵母耐受滲透壓的測定

制備不同糖濃度的YEPD 培養(yǎng)液，糖濃度分別為100 g/L、150 g/L、200 g/L、250 g/L、300 g/L、350 g/L、400 g/L、450 g/L、500 g/L、600 g/L、650 g/L、700 g/L，滅菌后接種培養(yǎng)計數(shù)。

1.2.2.4 酵母耐溫度的測定

制備YEPD 滅菌。設(shè)置培養(yǎng)箱的溫度梯度為28 ℃、30 ℃、33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃、43 ℃，滅菌后接種培養(yǎng)計數(shù)。

1.2.3 3株酵母復(fù)配甜酒曲中的應(yīng)用試驗

將酵母接種至根霉甜酒曲中培養(yǎng)成酒曲，將酒曲拌入蒸熟的米中發(fā)酵成酒，用氣相色譜法檢測酒中的風味物質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母分離純化的結(jié)果

經(jīng)過分離純化，得到13 株純化的性狀穩(wěn)定的酵母，分別為Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5、Y-6、Y-7、Y-8、Y-9、Y-10、Y-11、Y-12、Y-13，13 株純化酵母作為后續(xù)篩選的出發(fā)菌株。

2.1.1 酵母的TTC法初篩結(jié)果（圖1）

由圖1 可知，挑選顏色較紅的菌株，Y-3、Y-6、Y-7、Y-10、Y-12為復(fù)篩的預(yù)選菌株。

圖1 TTC法初篩結(jié)果

2.1.2 酵母的復(fù)篩

Y-3、Y-6、Y-7、Y-10、Y-12 經(jīng)過培養(yǎng)，接種到葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，單菌發(fā)酵的蒸餾液酒精含量的結(jié)果見圖2。

圖2 5株酵母單菌發(fā)酵蒸餾液酒精含量的結(jié)果

由圖2 可知，Y-10 單菌發(fā)酵蒸餾液的酒精含量最高為9.5%vol，可將其作為耐受性分析的預(yù)選菌株。將上述5 株酵母單菌發(fā)酵蒸餾液進行氣相色譜檢測，其氣相結(jié)果如表1—表5所示。

表1 酵母Y-3 單菌發(fā)酵蒸餾液氣相色譜圖譜分析結(jié)果

由表1—表5 可知，Y-3、Y-7 單菌發(fā)酵蒸餾液的風味物質(zhì)的含量較高，分別為4.07 mg/mL 和2.18 mg/mL。由單菌發(fā)酵蒸餾液的酒精含量柱形圖和氣相色譜測定結(jié)果可知，Y-10 單菌發(fā)酵蒸餾液的酒精含量最高為9.5%vol；Y-3 單菌發(fā)酵蒸餾液的風味物質(zhì)的總含量最高；Y-7 酵母菌株的呈香風味物質(zhì)較豐富，總物質(zhì)的含量僅次于Y-3，因此確定Y-3、Y-7、Y-10 3 株酵母作為后續(xù)菌株耐受性的出發(fā)菌株。

表2 酵母Y-6單菌發(fā)酵蒸餾液氣相色譜圖譜分析結(jié)果

表3 酵母Y-7單菌發(fā)酵蒸餾液氣相色譜圖譜分析結(jié)果

表4 酵母Y-10 單菌發(fā)酵蒸餾液氣相色譜圖譜分析結(jié)果

表5 酵母Y-12單菌發(fā)酵蒸餾液氣相色譜圖譜分析結(jié)果

2.2 酵母的耐受性分析結(jié)果

2.2.1 Y-3、Y-7、Y-10菌株酒精耐受性結(jié)果（圖3）

圖3 酒精耐受性結(jié)果

由圖3可知，隨著酒精含量的增加，酵母活菌數(shù)量減少，這是由于乙醇作為厭氧發(fā)酵的終產(chǎn)物對酵母是毒素和酶的抑制劑，高濃度底物相應(yīng)地也會使酵母生成較高濃度的酒精，達到一定濃度時，它能夠抑制酵母的生長、降低細胞存活率，影響細胞的活力，所以隨酒精濃度的增加，酵母的增殖速度及生存率下降，進一步提高酒精濃度，酵母的發(fā)酵會停止[8-9]。相比較而言，Y-7 菌株在酒精含量8%vol時，已經(jīng)不再增長，說明Y-7 的酒精最大抑制濃度為8%vol。隨著酒精含量的增加，到達10%vol時，Y-10 不再增長，說明Y-10 的酒精最大抑制濃度為10%vol。當酒精含量為12%vol 時，Y-3 不再增長，說明Y-3 的酒精最大抑制濃度為12%vol。綜上所述，Y-3的酒精耐受性高于Y-7和Y-10。

2.2.2 Y-3、Y-7、Y-10 酵母耐pH 值的測定結(jié)果（圖4）

圖4 pH耐受性結(jié)果

由圖4 可知，隨著培養(yǎng)基的pH 值越低，酵母活菌數(shù)量減少，這是由于在酸度較高的環(huán)境中，改變了營養(yǎng)物質(zhì)的電離狀態(tài)，降低它們被微生物利用的有效性，從而抑制了酵母的生長。從圖4 可以看出，pH 值耐受性順序為Y-7＞Y-10＞Y-3。當pH1.5 時，3 株酵母不再生長。表明3 株酵母pH 值的最小抑制值為1.5。

2.2.3 Y-3、Y-7、Y-10 酵母溫度耐受性的測定結(jié)果（圖5）

圖5 溫度耐受性結(jié)果

由圖5 可知，隨著溫度的升高，酵母數(shù)量逐漸減少，這是由于高溫使酵母的酶變性失活，抑制了酵母生長[10]。Y-7 酵母在28～37 ℃時，酵母生長速率最大，發(fā)酵能力較強，但當溫度達到39 ℃時，Y-7停止生長，說明Y-7 的溫度最大抑制值為39 ℃。Y-10 和Y-3相比，兩者的溫度最大抑制值為41 ℃，前者的生長速率抑制都高于Y-3，說明Y-10 在相同的高溫下生長速率優(yōu)于Y-3。2.2.4 Y-3、Y-7、Y-10 酵母滲透壓耐受性的測定結(jié)果（圖6—圖7）

圖6 滲透壓耐受性結(jié)果

圖7 Y-7在不同葡萄糖濃度的細胞形態(tài)（40×16）

由圖6 可知，隨著葡萄糖濃度的增加，酵母數(shù)量隨之減少到最低，當葡萄糖濃度再次增大時，酵母數(shù)量再次升高后再減少。這是由于酵母細胞具有適應(yīng)不同滲透壓環(huán)境的能力，當環(huán)境的滲透壓上升時，細胞會通過改變代謝途徑和細胞形態(tài)使?jié)B透壓保持平衡，避免細胞大量脫水[11]。在圖7b 中，Y-7 在葡萄糖濃度為500 g/L 時，其細胞形態(tài)發(fā)生改變，Y-7 由橢圓形變成連桿狀[12]。由圖6 可知，Y-3和Y-10 在葡萄糖濃度為700 g/L 時，滲透壓過高，細胞失水過多，導致酵母不再生長。綜上所述，Y-7 的滲透壓最大抑制濃度為600 g/L，Y-3 和Y-10 在高糖濃度下細胞沒有發(fā)生變形，兩者的滲透壓都高于Y-7，且滲透壓最大抑制濃度為700 g/L。

2.3 3 株酵母復(fù)配甜酒曲中的應(yīng)用試驗（表6、表7、表8）

表6 Y-3復(fù)配甜酒曲中的應(yīng)用試驗數(shù)據(jù)

表7 Y-7復(fù)配甜酒曲中的應(yīng)用試驗數(shù)據(jù)

表8 Y-10復(fù)配甜酒曲中的應(yīng)用試驗數(shù)據(jù)

由表8 可知，Y-10 的復(fù)配甜酒曲中的應(yīng)用試驗氣相數(shù)據(jù)表明黃酒中的風味物質(zhì)含量最高為3.3×105mg/L，種類多于8 種，其風味物質(zhì)的含量和種類高于其他2 株菌株。由表6 可知，Y-3 的試驗數(shù)據(jù)表明，黃酒中的風味物質(zhì)含量僅次于Y-10，為3.01×105mg/L，風味物質(zhì)種類多于7 種。由表7 可知，Y-7 的試驗數(shù)據(jù)表明，黃酒中的風味物質(zhì)含量為0.25×105mg/L，風味物質(zhì)的種類多于8 種。上述結(jié)果表明，Y-10 應(yīng)用到釀酒生產(chǎn)試驗可提高黃酒的風味和質(zhì)量。

3 結(jié)果與討論

從選育優(yōu)良酵母菌株著手，通過應(yīng)用到黃酒生產(chǎn)試驗，可以改善黃酒的風味物質(zhì)含量和種類，為黃酒的生產(chǎn)工藝提供了理論的指導。本實驗通過一系列的篩選，從各種酒曲中篩選出1 株發(fā)酵能力較強，耐受性較好，產(chǎn)香能力較高的酵母菌株Y-10。Y-10 一方面可以提高生產(chǎn)乙醇企業(yè)的生產(chǎn)率，提高經(jīng)濟效益，另一方面也可以提高黃酒中的風味物質(zhì)的含量和種類，改善黃酒的口感和香味。黃酒發(fā)酵是一個復(fù)雜的生物變化過程,其本質(zhì)就是稻米等原料經(jīng)霉菌糖化后酵母菌的酒化作用逐漸積累相關(guān)代謝產(chǎn)物,形成特定風味的過程。本文中雖然已經(jīng)篩選出1 株優(yōu)勢酵母菌株，但為了能提高黃酒的質(zhì)量，后期黃酒曲發(fā)酵還需要進行酵母、霉菌和米曲的復(fù)配試驗，優(yōu)化釀酒工藝流程來提高黃酒的風味和品質(zhì)。