趙孔祥，楊 爽，柴銘駿，劉 旸，葛寶坤

(天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，天津300461)

磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑，俗稱那非類藥物，以西地那非為代表，主要用于治療男性勃起功能障礙。近年來(lái)，抗疲勞類保健品在市場(chǎng)上大量銷售，多數(shù)消費(fèi)者認(rèn)為:保健食品藥效緩和、毒副作用小、可以長(zhǎng)期服用。但由于一些不法分子受利益驅(qū)使，為了增強(qiáng)其產(chǎn)品功效，在抗疲勞類保健品中大量非法添加壯陽(yáng)類化學(xué)成分。消費(fèi)者在不知情的情況下，長(zhǎng)期或超劑量服用含有那非類藥物的保健品，會(huì)出現(xiàn)頭暈、惡心、青光眼等癥狀，甚至對(duì)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等造成嚴(yán)重?fù)p傷[1-2]。

保健食品中磷酸二酯酶抑制劑的測(cè)定方法主要有表面增強(qiáng)拉曼光譜法[3-4]、高效液相色譜法[5-6]、液相色譜-質(zhì)譜法[7-11]以及高分辨質(zhì)譜法等[12-15]。表面增強(qiáng)拉曼光譜法簡(jiǎn)便快速，但容易受到基質(zhì)干擾且靈敏度不高。高效液相色譜法分離度高、專屬性較強(qiáng)、分析速率快，但分析復(fù)雜樣品時(shí)可能會(huì)有干擾，出現(xiàn)假陽(yáng)性。液相色譜-質(zhì)譜法兼具高效的分離能力和高專屬性、高靈敏度的特性，可以同時(shí)得到目標(biāo)化合物的保留時(shí)間、相對(duì)分子質(zhì)量、離子碎片等信息，從而對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證，提高了測(cè)定結(jié)果的可靠性，但受到方法的制約，只能對(duì)有限的目標(biāo)化合物開(kāi)展測(cè)定。高分辨質(zhì)譜法通過(guò)精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)一步提高了測(cè)定結(jié)果的可靠性，但靈敏度一般不如液相色譜-質(zhì)譜法。四極桿-靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜法的四極桿可根據(jù)質(zhì)荷比對(duì)目標(biāo)化合物離子進(jìn)行篩選，由C型離子阱對(duì)待測(cè)離子進(jìn)行富集，再運(yùn)送至靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜(Orbitrap)中獲取精確質(zhì)量數(shù)，同時(shí)運(yùn)用高能誘導(dǎo)裂解(HCD)技術(shù)，由HCD 裂解池碎裂后獲得豐富的碎片離子信息。根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)、同位素分布、二級(jí)質(zhì)譜圖相關(guān)性等在篩査的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)高靈敏度的定性確證及定量。近年來(lái)四極桿-靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜法在保健食品中非法添加成分測(cè)定方面的應(yīng)用逐漸增加[16-19]，已有研究者將其應(yīng)用于磷酸二酯酶抑制劑測(cè)定的報(bào)道[20]。

本工作采用液相色譜-四極桿-靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜法(LC-Q-Orbitrap)，建立了同時(shí)測(cè)定保健食品中11種磷酸二酯酶抑制劑的方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Q-Exactive型靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，配Transcent 1250型液相色譜儀；Millipore MILLI-Q型純水器；CR22GⅢ型高速離心機(jī)。

11 種磷酸二酯酶抑制劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:0.100 g·L－1，分別移取適量的伐地那非、那紅地那非、紅地那非、羥基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他達(dá)拉非、他達(dá)拉非、硫代艾地那非、偽伐地那非、那莫西地那非的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇稀釋而成。

11 種磷酸二酯酶抑制劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:1.00 mg·L－1，分別移取適量的0.100 g·L－1的11種磷酸二酯酶抑制劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用50%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇溶液稀釋混合而成。

甲醇、甲酸、乙腈均為色譜純；伐地那非標(biāo)準(zhǔn)品、那紅地那非標(biāo)準(zhǔn)品、紅地那非標(biāo)準(zhǔn)品、羥基豪莫西地那非標(biāo)準(zhǔn)品、西地那非標(biāo)準(zhǔn)品、豪莫西地那非標(biāo)準(zhǔn)品、氨基他達(dá)拉非標(biāo)準(zhǔn)品、他達(dá)拉非標(biāo)準(zhǔn)品、硫代艾地那非標(biāo)準(zhǔn)品、偽伐地那非標(biāo)準(zhǔn)品、那莫西地那非標(biāo)準(zhǔn)品的純度依次為99.3%，98.3%，99.6%，99.9%，99.9%，99.6%，99.9%，99.5%，99.5%，99.7%，99.9%；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Waters HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8μm)，柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積10μL；流量0.3 m L·min－1。流動(dòng)相:A 為0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲酸溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序:0～1.0 min時(shí)，B為2%；1.0～18.0 min時(shí)，B由2%升至100%，保持5.0 min；23.0～25.0 min時(shí)，B由100%降至2%。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，正離子模式(ESI＋)；毛細(xì)管電壓3 500 V；離子傳輸管溫度280 ℃，溶劑蒸發(fā)器溫度300 ℃；全掃描分辨率70 000，自動(dòng)觸發(fā)二級(jí)質(zhì)譜分辨率17 500；一級(jí)質(zhì)譜駐留時(shí)間100 ms，二級(jí)質(zhì)譜駐留時(shí)間50 ms；掃描質(zhì)荷比(m/z)120～750；二級(jí)質(zhì)譜采用自動(dòng)觸發(fā)方式產(chǎn)生碎片離子，碰撞裂解氣為高純氮?dú)?。其余質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取粉碎后的保健食品固體樣品2.00 g 于50 m L的離心管中，加入50 m L的50%甲醇溶液。

移取保健食品液體樣品10 m L，加入40 m L的50%甲醇溶液。

上述混合物渦旋混勻后，超聲提取15 min，溶液用水定容至50.0 m L，離心后，取上清液，經(jīng)0.22μm 微孔濾膜過(guò)濾后，按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

如果保健食品樣品中某成分檢出量超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，需要進(jìn)行適當(dāng)稀釋，重新分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

50μg·L－1的11種磷酸二酯酶抑制劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 提取溶劑的選擇

樣品的提取溶劑有水、甲醇、乙腈和乙醇等。根據(jù)11種磷酸二酯酶抑制劑的物理溶解性質(zhì)，采用水和有機(jī)溶劑的混合溶液作為提取溶劑。試驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水、乙醇-水等3種提取溶劑對(duì)11種磷酸二酯酶抑制劑回收率的影響。結(jié)果表明:以甲醇-水作為提取溶劑時(shí)，11種磷酸二酯酶抑制劑的回收率相對(duì)較高。試驗(yàn)選擇提取溶劑為50%甲醇溶液。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

1.00 mg·L－1的11種磷酸二酯酶抑制劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液通過(guò)流動(dòng)注射直接注入質(zhì)譜儀，電離方式優(yōu)化表明11種磷酸二酯酶抑制劑在電噴霧正離子模式下靈敏度最高。采集11種磷酸二酯酶抑制劑母離子的精確質(zhì)量數(shù)(見(jiàn)表1)。每種磷酸二酯酶抑制劑的理論精確質(zhì)量數(shù)與實(shí)測(cè)精確質(zhì)量數(shù)相對(duì)誤差的絕對(duì)值都小于5×10－4%，靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜可以提供高的可信度。優(yōu)化碰撞能量，獲得二級(jí)碎片信息，各種磷酸二酯酶抑制劑的多個(gè)子離子精確質(zhì)量數(shù)見(jiàn)表1。子離子精確質(zhì)量數(shù)的比對(duì)提高了測(cè)定結(jié)果的可靠性。進(jìn)一步優(yōu)化離子源霧化條件，獲得最佳的靈敏度。試驗(yàn)選擇的質(zhì)譜條件見(jiàn)1.2節(jié)。

2.4 色譜條件的選擇

超高壓液相色譜(UPLC)柱由于粒徑小，可以在低流量獲得較高的柱效，因此試驗(yàn)采用100 mm的UPLC柱進(jìn)行優(yōu)化。磷酸二酯酶抑制劑的極性差別較大，試驗(yàn)對(duì)比了Waters HSS T3、Shield RP C18和BEH C18等3種色譜柱，由于Waters HSS T3色譜柱提升了極性化合物的保留，并且可以耐受高比例的水相和流動(dòng)相，在低p H 下色譜柱壽命較長(zhǎng)，且Waters HSS T3色譜柱的分離度優(yōu)于其他兩種色譜柱。因此，試驗(yàn)選用Waters HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8μm)。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

流動(dòng)相的組成對(duì)峰形、靈敏度及分離度有較大的影響。試驗(yàn)分別以乙腈和甲醇作為強(qiáng)洗脫溶劑，0.1%甲酸溶液、10 mmol·L－1乙酸銨溶液以及含0.02%甲酸的10 mmol·L－1乙酸銨溶液作為弱洗脫溶劑，互相組合進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在流動(dòng)相中增加0.1%甲酸溶液能夠改善大部分目標(biāo)物的峰形，且能提高靶標(biāo)物質(zhì)的離子化效率，從而增強(qiáng)化合物的響應(yīng)。試驗(yàn)中部分化合物保留時(shí)間較長(zhǎng)，考慮到乙腈比甲醇洗脫能力強(qiáng)，采用乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。通過(guò)優(yōu)化梯度洗脫程序，大部分磷酸二酯酶抑制劑峰形對(duì)稱，可實(shí)現(xiàn)基線分離。

表1(續(xù))

綜合考慮，試驗(yàn)選擇0.1%甲酸溶液和乙腈作為流動(dòng)相。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

采用50%甲醇溶液對(duì)1.00 mg·L－1的11種磷酸二酯酶抑制劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋，得到2，5，10，20，50，100μg·L－1的11種磷酸二酯酶抑制劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按儀器工作條件對(duì)上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:11種磷酸二酯酶抑制劑的質(zhì)量濃度均在2～100μg·L－1內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。根據(jù)10倍信噪比計(jì)算方法的測(cè)定下限(10S/N)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和測(cè)定下限Tab.2 Linear regression equations，correlation coefficients and lower limits of determination

考慮樣品稀釋倍數(shù)，液體樣品測(cè)定下限為0.1～2.5μg·kg－1，固體樣品測(cè)定下限為0.5～12.5μg·kg－1。

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對(duì)空白活力捷液樣品(樣品1)和空白鋅補(bǔ)晶粉樣品(樣品2)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知:回收率為75.7%～98.9%，RSD 為5.9%～14%。

2.7 樣品分析

按試驗(yàn)方法對(duì)32個(gè)市售及電商平臺(tái)的保健食品樣品進(jìn)行分析，其中1個(gè)電商平臺(tái)的瑪卡片樣品中西地那非的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為51.89 g·kg－1(提取液稀釋10 000倍)，其色譜圖和一級(jí)、二級(jí)高分辨質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6) %

圖2 樣品色譜圖和一級(jí)、二級(jí)高分辨質(zhì)譜圖Fig.2 Chromatogram of the sample and primary as well as secondary high resolution mass spectra

由圖2可知:色譜保留時(shí)間、母離子精確質(zhì)量數(shù)以及二級(jí)高分辨質(zhì)譜圖均與標(biāo)準(zhǔn)譜圖一致，進(jìn)一步確認(rèn)了西地那非在樣品中的存在。個(gè)別保健食品樣品中確實(shí)存在磷酸二酯酶抑制劑非法添加問(wèn)題。

本工作采用液相色譜-四極桿-靜電軌道阱高分辨質(zhì)譜法測(cè)定保健食品中11種磷酸二酯酶抑制劑的含量。高分辨質(zhì)譜法提供的精確質(zhì)量數(shù)信息提高了測(cè)定結(jié)果的可靠性。