居紅格，李 峰，馬俊兵，張文連，賀 帥，張 偉

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害女性生命健康。乳腺癌是一組高異質(zhì)性的腫瘤，不同分子亞型其臨床病理特點(diǎn)、治療方法及預(yù)后各不相同。其中三陰型乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)約占所有乳腺癌總數(shù)的13%[1]。與其它分子亞型相比，TNBC侵襲性強(qiáng)、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化、酶聯(lián)免疫和qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)TNBC組織和血清中RHBDD1和EGFR mRNA含量及蛋白表達(dá)，為TNBC治療尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2015年～2018年在包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院及包頭市腫瘤醫(yī)院行乳腺癌根治性切除術(shù)的患者為研究對(duì)象，每例均切取乳腺癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁正常乳腺組織，用于提取RNA及石蠟包埋。采集乳腺癌患者血清儲(chǔ)存于-80 ℃用于酶聯(lián)免疫檢測(cè)，隨機(jī)選取60例健康體檢者(無腫瘤病史及家族史)血清作為對(duì)照組。對(duì)所有乳腺癌組織進(jìn)行ER、PR、HER2免疫組化檢測(cè)，30例ER、PR、HER2均陰性，為TNBC組，從其余乳腺癌患者中隨機(jī)選取30例作為非三陰型乳腺癌(non triple negative breast cancer, NTNBC)組(ER、PR、HER2至少一項(xiàng)陽(yáng)性)，所選病例患者年齡26～82歲，中位年齡51歲。按照Nottingham組織學(xué)分級(jí)系統(tǒng)[2]進(jìn)行計(jì)分及組織學(xué)分級(jí)，根據(jù)腺管數(shù)量(1～3分)、核異型程度(1～3分)、核分裂項(xiàng)計(jì)數(shù)(1～3分)計(jì)分，Ⅰ級(jí)3～5分，Ⅱ級(jí)6～7分，Ⅲ級(jí)8～9分；所有病理切片均由兩位高級(jí)職稱病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行判讀。采用美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)乳腺癌TNM分期進(jìn)行臨床分期。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 采用免疫組化MaxVision法進(jìn)行免疫組化染色，手術(shù)切除標(biāo)本先經(jīng)10%中性福尓馬林固定，然后脫水、石蠟包埋、脫蠟、水化、抗原修復(fù)、滴加抗體、DAB顯色、復(fù)染、封片。試劑盒購(gòu)自福州邁新公司，所有操作步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：所有結(jié)果均經(jīng)診斷醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行確認(rèn)。根據(jù)染色程度進(jìn)行評(píng)分：基本不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，計(jì)算出每個(gè)視野陽(yáng)性染色腫瘤細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，并取其平均值進(jìn)行評(píng)分：陽(yáng)性染色腫瘤細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)<1為0分，10%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，75%～100%為4分。最后將兩項(xiàng)評(píng)分結(jié)果相乘：0分為陰性(-)；1～12分陽(yáng)性。其中l(wèi)～4分為(+)，5～8分為()，9～12分為()。

1.2.2酶聯(lián)免疫法 檢測(cè)乳腺癌患者血清中RHBDD1和EGFR蛋白，試劑盒均購(gòu)自武漢新啟迪生物公司。從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗(yàn)所需的板條，預(yù)留空白孔，分別將標(biāo)本加入相應(yīng)孔中37 ℃孵育90 min，洗板2次，加入生物素化人RHBDD1或EGFR抗體工作液，37 ℃孵育60 min，洗板3次，除空白孔外，加入酶結(jié)合物工作液。37 ℃避光孵育30 min，洗板5次。加入酶結(jié)合物工作液，37 ℃避光孵育，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線高濃度的顏色較深，有明顯的顏色梯度時(shí)即可終止。加入終止液，混勻后即刻測(cè)量OD(450 nm)值。

1.2.3qRT-PCR 采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)乳腺癌中RHBDD1 mRNA的含量。RNA提取試劑盒(DP431)購(gòu)自天根生化公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(#k1621)購(gòu)自Thermo Scientific公司。qRT-PCR試劑盒(B532955)購(gòu)自上海生工生物公司。RHBDD1、EGFR和β-actin的引物序列由上海生工生物公司合成。β-actin的引物序列：上游5′-TGTCCCTGTA CACCTCTG-3′，下游5′-ATGTCACGCACGATTTCCC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為217 bp。RHBDD1的引物序列：上游5′-GCCTATGTTATCACCGCATTTTC-3′，下游5′-GCTCCTTTTGAAGTCAGGTTCAT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為102 bp。EGFR引物序列：上游5′-GGACTCTGGA TCCCAGAAGGTG-3′，下游5′-GCTGGCCATCACG TAGGCTT-3′，產(chǎn)物大小為244 bp。qRT-PCR的反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為恒溫段：95 ℃ 30 s，循環(huán)段：95 ℃ 5 s ，然后60 ℃ 30 s ，熔解段：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 h，95 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。

記錄CT值，計(jì)算ΔCT和ΔΔCT值，最后結(jié)果取ΔΔCT的均值，即為RHBDD1 mRNA和EGFR mRNA的相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料比較采χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用r相關(guān)性分析和Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中ER、PR、HER2的表達(dá)ER、PR陽(yáng)性定位于細(xì)胞核，HER2陽(yáng)性定位于細(xì)胞膜，與乳腺癌診療規(guī)范(2018)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)一致。把ER、PR、HER2均陰性歸為TNBC組，把ER、PR、HER2至少一項(xiàng)陽(yáng)性歸為NTNBC組。

2.2 TNBC和NTNBC組織中RHBDD1和EGFR的表達(dá)采用免疫組化法對(duì)TNBC和NTNBC組織和癌旁組織中RHBDD1和EGFR蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示RHBDD1陽(yáng)性定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，EGFR陽(yáng)性定位于細(xì)胞膜(圖1、2)，RHBDD1在TNBC組中的陽(yáng)性率(83%)高于NTNBC組(67%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，EGFR在TNBC組中的陽(yáng)性率(80%)明顯高于NTNBC組(37%)，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RHBDD1和EGFR在TNBC中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=3.723，P<0.05)。RHBDD1和EGFR在TNBC組和NTNBC組中的表達(dá)均與患者年齡無關(guān)，與臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(表1)。

2.3 乳腺癌患者和健康體檢者血清中RHBDD1和EGFR的濃度采用酶聯(lián)免疫法對(duì)60例乳腺癌患者和60例健康體檢者血清進(jìn)行RHBDD1和EGFR檢測(cè)，結(jié)果顯示乳腺癌患者血清中RHBDD1、EGFR含量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TNBC組RHBDD1、EGFR的含量高于NTNBC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

2.4 TNBC和癌旁正常乳腺組織中RHBDD1 mRNA和EGFR mRNA的含量以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)對(duì)30例TNBC和癌旁正常乳腺組織中RHBDD1和EGFR進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)2%的凝膠電泳，證實(shí)為RHBDD1、EGFR，長(zhǎng)度分別102、244 bp(圖4)。

表1 三陰型乳腺癌和非三陰型乳腺癌組織中RHBDD1和EGFR的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[(n)%]

①A①B②A②B

圖1非三陰型乳腺癌中RHBDD1(A)和EGFR(B)呈強(qiáng)陽(yáng)性，MaxVision法圖2非三陰型乳腺癌中RHBDD1(A)和EGFR(B)呈陰性，MaxVision法

圖3 不同組別血清中RHBDD1和EGFR濃度檢測(cè)NTNBC組. 非三陰型乳腺癌組；TNBC組. 三陰型乳腺癌組

圖4 三陰型乳腺癌組織中RHBDD1、EGFR基因擴(kuò)增PCR凝膠電泳：M.Marke；1～3.EGFR；4～6.RHBDD1

TNBC組中RHBDD1 mRNA和EGFR mRNA的含量均高于癌旁正常組，分別是3.68倍和4.56倍，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中RHBDD1 mRNA和EGFR mRNA的含量分別是無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的4.72倍和5.31倍，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的RHBDD1 mRNA和EGFR mRNA的含量顯著高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組，分別是4.89倍和5.55倍(圖5)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 三陰型乳腺癌組織中RHBDD1 mRNA、EGFR mRNA的相對(duì)含量

3 討論

TNBC是乳腺浸潤(rùn)癌的一種分子亞型，不表達(dá)ER、PR和HER2，TNBC患者的內(nèi)分泌治療和抗HER2的靶向治療效果不佳，且預(yù)后差，易復(fù)發(fā)，易侵襲轉(zhuǎn)移，病死率較高?，F(xiàn)在對(duì)于TNBC患者，主要是行常規(guī)手術(shù)切除治療和化療[4-5]，也有學(xué)者對(duì)晚期TNBC患者進(jìn)行全身治療的諸多試驗(yàn)正在進(jìn)行，并取得了一定成果[6]。近幾年，國(guó)內(nèi)外研究者尋求TNBC治療的新分子靶點(diǎn)，針對(duì)TNBC患者采用個(gè)體化靶向治療，使乳腺癌患者最終受益。

EGFR是表皮生長(zhǎng)因子受體家族的一個(gè)成員，其可以激活下游通路，導(dǎo)致細(xì)胞增殖分化，促使腫瘤形成。國(guó)內(nèi)外許多研究結(jié)果表明EGFR在乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等許多腫瘤中出現(xiàn)異常高表達(dá)，其通過激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[7-9]。

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè)EGFR在TNBC組織中高表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[10]。采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)乳腺癌患者血清中EGFR的表達(dá)，血清中EGFR含量高于健康人群，TNBC組患者血清中EGFR的含量明顯高于NTNBC組?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)外研究對(duì)EGFR下游通路活化的機(jī)制較為清楚，但是如何調(diào)控和激活EGFR一直是眾多研究者所關(guān)注的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)組在前期實(shí)驗(yàn)[11]發(fā)現(xiàn)RHBDD1和EGFR在乳腺癌中的表達(dá)呈正相關(guān)，RHBDD1可能激活EGFR，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移。

RHBDD1是新發(fā)現(xiàn)的Rhomboid家族成員，Rhomboid家族包含一個(gè)特殊的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，是一類能夠切割單一跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白酶，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的作用[12-13]，有文獻(xiàn)報(bào)道[14]RHBDD1在乳腺癌組織中高表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)組從乳腺癌患者組織和血清中發(fā)現(xiàn)RHBDD1高表達(dá)，尤其是TNBC組明顯高于NTNBC組，相關(guān)性分析結(jié)果表明RHBDD1表達(dá)與TNBC的發(fā)病年齡無關(guān)，與臨床分期、病理分級(jí)、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，TNBC組中RHBDD1和EGFR表達(dá)呈正相關(guān)。提示RHBDD1可能在癌組織中發(fā)揮上調(diào)EGFR蛋白的作用，激活EGFR下游通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有研究[15]證實(shí)RHBDD1可以通過調(diào)節(jié)C-Jun的表達(dá)來調(diào)節(jié)EGFR mRNA的表達(dá)。隨后對(duì)TNBC組織提取的RNA進(jìn)行了qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明在TNBC組織中RHBDD1 mRNA和EGFR mRNA的含量高于癌旁組織，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的組織中，尤其是發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的組織，RHBDD1 mRNA和EGFR mRNA的含量更高，從核酸水平進(jìn)一步證實(shí)RHBDD1和EGFR在TNBC發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)從組織和血清兩方面進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)到RHBDD1和EGFR蛋白在TNBC中高表達(dá)，從蛋白和RNA水平兩方面均說明RHBDD1和EGFR在TNBC的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中具有協(xié)同作用，RHBDD1和EGFR可作為TNBC預(yù)后和臨床診療的分子靶點(diǎn)，為TNBC的臨床診治提供新的理論基礎(chǔ)。