徐寧 殷慧文 張寧 劉建曉 王曉莉 趙巖松

視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷(retinal ischemia-reperfusion injury,RIRI)可見(jiàn)于多種眼部疾病，如視網(wǎng)膜血管閉塞、糖尿病視網(wǎng)膜病變和青光眼等[1]，是目前致盲的主要原因之一。N-乙酰-5-羥色胺(N-acetylserotonin,NAS)屬于吲哚類激素，是一種天然存在的化學(xué)中間體，是褪黑素的前體物質(zhì)。有研究表明，NAS對(duì)缺血性疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型均具有神經(jīng)保護(hù)作用[2]。本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)，NAS可通過(guò)抑制活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Fas/FasL、Bax蛋白的表達(dá)和促進(jìn)Bcl-2蛋白的表達(dá)而減輕RIRI大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡[3-4]，進(jìn)一步證明NAS對(duì)RIRI的神經(jīng)有保護(hù)作用。鑒于不同的給藥途徑療效不同，本研究采用升高眼壓法建立RIRI模型，探討腹腔與靜脈注射兩種不同NAS給藥途徑對(duì)RIRI大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)、活性Caspase-3蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響，以期為NAS治療RIRI的臨床最佳給藥途徑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康無(wú)眼疾成年Sprague-Dawley雄性大鼠54只，體質(zhì)量200～250 g。經(jīng)裂隙燈檢查大鼠的眼前節(jié)及后節(jié)均無(wú)異常，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=6)、RIRI腹腔組(n=12)、RIRI靜脈組(n=12)、NAS腹腔組(n=12)和NAS靜脈組(n=12)。正常對(duì)照組不作處理，后四組建立RIRI模型。NAS腹腔組和NAS靜脈組于建模前30 min分別經(jīng)腹腔、尾靜脈按10 mg·kg-1體質(zhì)量注射N(xiāo)AS，RIRI腹腔組和RIRI靜脈組于造模前30 min分別經(jīng)腹腔、尾靜脈注射同等劑量的生理鹽水。RIRI腹腔組、RIRI 靜脈組、NAS腹腔組及NAS靜脈組依據(jù)RIRI后時(shí)間分為24 h及7 d兩個(gè)亞組(n=6)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)使用條件均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的規(guī)定。

1.1.2 主要試劑及儀器NAS(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)，兔抗活性Caspase-3抗體、兔抗二步法試劑盒、DAB顯色劑試劑盒、HE染色試劑盒(中國(guó)Servicebio公司)，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Roche公司)。電子分析天平(AL-204，美國(guó)Mettler Toledo公司)，石蠟切片機(jī)(Shandon Finesse325，英國(guó)珊頓公司)，正置熒光顯微鏡(BX-51，日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 RIRI模型制作采用前房加壓灌注升高眼壓法制作RIRI動(dòng)物模型。100 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉，統(tǒng)一選取各組大鼠右眼，復(fù)方托吡卡胺散瞳，鹽酸奧布卡因表面麻醉，微量注射器自大鼠右眼顳側(cè)角膜緣刺入前房并固定，升高輸液瓶高度使眼內(nèi)形成110 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)的眼壓，此時(shí)可見(jiàn)大鼠前房加深，球結(jié)膜蒼白，直接檢眼鏡見(jiàn)眼底視網(wǎng)膜血管白線，血流中斷；持續(xù)灌注60 min后緩慢降低輸液瓶高度至眼平面水平，恢復(fù)正常眼壓，此時(shí)可見(jiàn)大鼠眼球色紅，眼底血管清晰，提示RIRI模型建立成功。

1.2.2 標(biāo)本的采集及石蠟切片的制作分別于RIRI后24 h、7 d，各組分別隨機(jī)取大鼠右側(cè)眼球6只，40 g·L-1多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明后浸蠟包埋。沿視神經(jīng)矢狀軸作非連續(xù)切片，切片厚度約為4 μm。RIRI后24 h，各組視網(wǎng)膜組織行免疫組織化學(xué)染色和TUNEL染色；RIRI后7 d，各組視網(wǎng)膜組織行HE染色。

1.2.3 HE染色石蠟切片脫蠟至水，蘇木素染核，伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。采用Cellsens 1.6圖像分析軟件，隨機(jī)選取4點(diǎn)測(cè)量大鼠視網(wǎng)膜距視盤(pán)外200 μm 處100 μm長(zhǎng)度內(nèi)的內(nèi)界膜到外叢狀層內(nèi)層內(nèi)緣厚度，取均值作為視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度，并計(jì)算距視盤(pán)邊緣100 μm處100 μm長(zhǎng)度內(nèi)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell，RGC)層單位面積RGC數(shù)。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色石蠟切片脫蠟水化，抗原修復(fù)，體積分?jǐn)?shù)3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，山羊血清封閉，加入兔抗活性Caspase-3(175)4 ℃ 冰箱過(guò)夜；復(fù)溫后使用0.01 mol·L-1PBS沖洗，加入兔抗大鼠多克隆抗體，DAB顯色，蘇木素染核，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)算單位面積活性Caspase-3染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 TUNEL染色檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡按照TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，DAB顯色，蘇木素染核，脫水、透明，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。每只大鼠取4～5張非連續(xù)切片，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)400倍視野，計(jì)算單位面積 TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果光學(xué)顯微鏡下觀察可見(jiàn)，正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜各層分界清楚，視網(wǎng)膜細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞排列緊密、規(guī)整。RIRI后7 d，與正常對(duì)照組相比，RIRI腹腔組和RIRI靜脈組視網(wǎng)膜層次可，各層組織形態(tài)欠規(guī)則，細(xì)胞排列疏松、紊亂；視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度明顯變薄，RGC數(shù)目明顯減少，與正常對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；RIRI腹腔組與RIRI靜脈組間視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度、RGC數(shù)目比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。RIRI后7 d，NAS腹腔組視網(wǎng)膜層次較清晰，各層組織形態(tài)較規(guī)則，細(xì)胞排列較規(guī)整；NAS靜脈組視網(wǎng)膜各層形態(tài)及細(xì)胞排列均趨于正常。NAS腹腔組、NAS靜脈組較RIRI腹腔組和RIRI靜脈組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層變薄程度及RGC數(shù)目減少程度均減輕，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，且NAS靜脈組變化程度均較NAS腹腔組更明顯，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；但NAS靜脈組、NAS腹腔組視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度、RGC數(shù)目與正常對(duì)照組相比差異仍均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 RIRI后7 d，各組大鼠視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果(×400) A：正常對(duì)照組，視網(wǎng)膜各層分界清楚，視網(wǎng)膜細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞排列緊密、規(guī)整；B、C： RIRI腹腔組和RIRI靜脈組，視網(wǎng)膜層次可，各層組織形態(tài)欠規(guī)則，細(xì)胞排列疏松、紊亂；D：NAS腹腔組，視網(wǎng)膜層次較清晰，各層組織形態(tài)較規(guī)則，細(xì)胞排列較規(guī)整；E：NAS靜脈組，視網(wǎng)膜各層形態(tài)及細(xì)胞排列均趨于正常

組別視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度/μm RGC數(shù)/個(gè)·mm-2Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/個(gè)·mm-2TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/個(gè)·mm-2正常對(duì)照組96.71±1.41721.07±45.9175.92±14.79644.18±75.90RIRI腹腔組82.37±1.09a390.72±72.12a387.79±26.72a2140.53±177.96aRIRI靜脈組82.81±0.90a434.42±87.17a380.54±41.25a2122.77±165.76aNAS腹腔組87.80±1.33ab529.25±92.05ab221.34±30.84ab1968.96±254.98abNAS靜脈組91.67±1.43abc616.90±79.51abc145.01±22.54abc1468.03±128.40abcF值868.28046.510531.830304.050P值0.0000.0000.0000.000

注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與RIRI腹腔組、RIRI靜脈組比較，bP<0.05；與NAS腹腔組比較，cP<0.05

2.2 活性Csapase-3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果活性Csapase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞核棕黃色染色，主要見(jiàn)于RGC層和內(nèi)核層。正常對(duì)照組視網(wǎng)膜偶見(jiàn)活性Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞。RIRI后24 h，RIRI腹腔組和RIRI靜脈組視網(wǎng)膜可見(jiàn)大量的活性Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞，與正常對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05),但2組間活性Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；NAS腹腔組、NAS靜脈組活性Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較RIRI腹腔組和RIRI靜脈組均減少，且NAS靜脈組活性Caspase-3陽(yáng)性數(shù)顯著低于NAS腹腔組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；但NAS腹腔組、NAS靜脈組活性Caspase陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)仍均高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。見(jiàn)圖2、表1。

圖2 RIRI后24 h，各組大鼠視網(wǎng)膜活性Caspase-3蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×400) A：正常對(duì)照組，幾乎未見(jiàn)活性Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞；B、C： RIRI腹腔組和RIRI靜脈組，可見(jiàn)大量活性Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞；D、E：NAS腹腔組和NAS靜脈組，可見(jiàn)較少活性Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞。箭頭示活性Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞

2.3 TUNEL染色結(jié)果大鼠視網(wǎng)膜TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕色，主要位于RGC層和內(nèi)核層。正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜偶見(jiàn)TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞。RIRI后24 h，與正常對(duì)照組相比，RIRI腹腔組、RIR靜脈組、NAS腹腔組、NAS靜脈組TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；RIRI腹腔組與RIRI靜脈組間TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與RIRI腹腔組和RIRI靜脈組相比，NAS腹腔組、NAS靜脈組TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；與NAS腹腔組相比，NAS靜脈組TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)降低更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表1。

圖3 RIRI后24 h，各組大鼠視網(wǎng)膜TUNEL染色結(jié)果(×400) A：正常對(duì)照組，偶見(jiàn)TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞；B、C： RIRI腹腔組和RIRI靜脈組，可見(jiàn)大量TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞；D、E：NAS腹腔組和NAS靜脈組，可見(jiàn)較少TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞。箭頭示TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞

3 討論

近年來(lái)關(guān)于RIRI的研究越來(lái)越多，特別是各種藥物的治療效果，然而目前對(duì)RIRI仍缺乏行之有效的治療方案，RIRI的預(yù)防與治療已成為目前眼科學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。NAS作為褪黑素的前體物質(zhì)，經(jīng)芳香胺-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(AANAT)催化后由5-羥色胺合成，其主要表達(dá)于松果腺和視網(wǎng)膜中，NAS不僅在眼部疾病，在神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)等疾病上的研究也取得了很多的成就[5-7]。NAS在RIRI中主要通過(guò)抗細(xì)胞凋亡、拮抗氧自由基、干預(yù)炎癥反應(yīng)等途徑對(duì)神經(jīng)保護(hù)起著重要作用[8]。張婷婷等[3]研究表明，NAS腹腔注射可抑制RIRI后的視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，具有神經(jīng)保護(hù)作用。然而迄今為止，尚未見(jiàn)有研究比較不同NAS給藥途徑對(duì)RIRI的影響，而靜脈注射可極大程度提高血藥濃度，故本研究擬通過(guò)組織病理學(xué)、免疫組織化學(xué)染色和TUNEL染色法比較腹腔注射與尾靜脈注射兩種途徑對(duì)RIRI的保護(hù)作用。

研究發(fā)現(xiàn)，RIRI后7 d，大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)開(kāi)始出現(xiàn)較明顯的漸進(jìn)性損傷，包括視網(wǎng)膜厚度變薄、RGC損害等[9]，故本研究選取RIRI后7 d對(duì)大鼠視網(wǎng)膜行HE染色，觀察腹腔和靜脈注射兩種給藥途徑的NAS對(duì)RIRI大鼠視網(wǎng)膜組織病理形態(tài)學(xué)的影響。結(jié)果顯示，RIRI后7 d，RIRI靜脈組和RIRI腹腔組大鼠視網(wǎng)膜層次可，各層組織形態(tài)欠規(guī)則，細(xì)胞排列疏松、紊亂，視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度變薄、RGC數(shù)目均明顯減少；NAS腹腔組、NAS靜脈組大鼠視網(wǎng)膜層次較清晰，各層組織形態(tài)較規(guī)則，細(xì)胞排列較規(guī)整，視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度變薄程度、RGC數(shù)目減少程度均較RIRI靜脈組和腹腔組明顯減輕，且NAS靜脈組大鼠各層視網(wǎng)膜組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度和RGC數(shù)目均趨于正常。其中，RIRI后視網(wǎng)膜細(xì)胞的減少主要出現(xiàn)在內(nèi)5層，尤其是RGC層和內(nèi)核層，其中包含的主要細(xì)胞為RGC、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞、雙極細(xì)胞和水平細(xì)胞，這與文獻(xiàn)報(bào)道是一致的[10]。提示NAS靜脈治療途徑能更好地減輕RIRI大鼠視網(wǎng)膜的病理學(xué)損傷，這可能是由于靜脈注射給藥可使藥物直接進(jìn)入血液循環(huán)，起效快，損耗小，而腹腔注射則要經(jīng)過(guò)首關(guān)消除，因此會(huì)導(dǎo)致藥物的大量損耗；另外，也可能由于靜脈注射的吸收速度比腹腔注射快得多，因而靜脈注射更容易達(dá)到更高的血藥濃度，從而產(chǎn)生更強(qiáng)烈的反應(yīng)。

細(xì)胞凋亡在RIRI中的重要作用日益凸顯，是心、腦、腸及視網(wǎng)膜等組織RIRI中細(xì)胞死亡的主要形式。凌士奇等[11]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，RIRI大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層細(xì)胞的凋亡征象尤以再灌注24 h時(shí)最為顯著，而Caspase是細(xì)胞凋亡過(guò)程中尤為重要的蛋白酶，凋亡最后的實(shí)施是靠Caspase的激活而實(shí)現(xiàn)的，Caspase的激活是一種“瀑布式”的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中下行的最關(guān)鍵的執(zhí)行蛋白酶，在各種凋亡程序中起最后樞紐的作用[12]。因此，本研究通過(guò)對(duì)RIRI后24 h的活性Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的觀察，探討NAS腹腔和靜脈注射兩種給藥途徑對(duì)RIRI大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，NAS腹腔組、NAS靜脈組在RIRI后24 h活性Caspase-3蛋白的表達(dá)和TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均少于RIRI腹腔組和RIRI靜脈組，且NAS靜脈組活性Caspase-3蛋白的表達(dá)和TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均少于NAS腹腔注射組。提示腹腔與靜脈注射N(xiāo)AS均可不同程度地減輕RIRI大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，且NAS靜脈注射的療效優(yōu)于NAS腹腔注射。

總之，靜脈與腹腔注射N(xiāo)AS均可減少RIRI后視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡，從而減輕RIRI大鼠視網(wǎng)膜損傷，且靜脈給藥較腹腔給藥療效更為顯著。本研究為NAS治療RIRI的最佳途徑選擇提供了一定的理論依據(jù)。