占秋曉，李丹丹，劉 璐，鞠春曉，薛 冰，徐鳳芹

高血壓以體循環(huán)動脈壓升高為特征，并可伴隨心、腦、腎等靶器官損害。我國高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)為收縮壓≥140mmHg(1mmHg=0.133kPa)和(或)舒縮壓≥90 mmHg[1]，而在最新版美國高血壓指南[2-3]中，其診斷標(biāo)準(zhǔn)更為嚴(yán)格。高血壓的病因和發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，在高血壓的治療過程中，單一靶向某一特定靶點(diǎn)或某一特定因素有時并不能將血壓控制在滿意范圍，對于一些頑固高血壓病人需要3種甚至4種降壓藥連用。中藥具有多組分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，在治療高血壓等由多基因、多因素導(dǎo)致的疾病中具有優(yōu)勢。

中醫(yī)學(xué)中并沒有高血壓這一特定病名，按照癥狀，高血壓在中醫(yī)學(xué)分屬“眩暈”“頭痛”“中風(fēng)”等范疇。中醫(yī)學(xué)將高血壓分為肝陽上亢、痰濕內(nèi)盛、瘀血內(nèi)停、肝腎陰虛及腎陽虛衰5個證型，治療時病證結(jié)合、辨證施治。蓮子心為睡蓮科植物蓮成熟種子的綠色胚芽，其味苦、性寒，能清心安神、交通心腎、澀精止血，可用于熱入心包、神昏譫語、心腎不交、失眠遺精、血熱吐血等癥治療中。中醫(yī)學(xué)在長期的臨床實(shí)踐中也發(fā)現(xiàn)蓮子心具有治療高血壓的作用，這在雷燕等[4]臨床研究中得到證實(shí)，此外在高楓等[5]關(guān)于高血壓合并動脈粥樣硬化的臨床實(shí)驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)蓮子心在治療高血壓的同時還具有抗粥樣硬化作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，對特定生物系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，用于輔助新藥研發(fā)的一種方法。通過借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法不僅可以輔助了解中藥的毒副作用，探索中藥的治療機(jī)制，還有助于中藥現(xiàn)代化為臨床用藥提供參考價值[6]。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法探討蓮子心治療高血壓的可能機(jī)制，以期為后續(xù)基礎(chǔ)研究及臨床用藥提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 篩選活性成分，構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)是一個為中藥研究提供在線中藥化學(xué)組成、毒藥物動力學(xué)(absorption，distribution， metabolism and excretion， ADME)、作用靶點(diǎn)等信息，并捕捉靶點(diǎn)與疾病之間關(guān)系的藥理學(xué)平臺，其涵蓋了449味中藥數(shù)據(jù)，通過在TCMSP中輸入需要檢索單味中藥可以較全面地檢索到其化學(xué)組分及作用靶點(diǎn)等信息[7]。BATMAN-TCM (a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine， BATMAN-TCM)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm)也是一個專門用于研究中藥作用靶點(diǎn)的在線生物信息學(xué)分析工具[8]。UniProt(Universal Protein， UniProt)(http://www.uniprot.org/)整合了多個數(shù)據(jù)庫的信息，是一個免費(fèi)在線的較為豐富全面的蛋白數(shù)據(jù)庫。通過借助上述3個平臺，在TCMSP及BATMAN-TCM兩個數(shù)據(jù)庫中檢索蓮子心的化學(xué)組成及靶點(diǎn)蛋白信息。隨后將得到的靶點(diǎn)蛋白信息輸入UniProt數(shù)據(jù)庫，在庫中檢索靶點(diǎn)蛋白所對應(yīng)的靶基因名稱，并通過Cytoscape3.6.1軟件構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”。

1.2 構(gòu)建疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(Therapeutic Target Database， TTD)(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、比較毒物遺傳數(shù)據(jù)庫(Comparative Toxicogenomics Database，CTD)(http://ctdbase.org/)及DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)是面向醫(yī)藥等研究領(lǐng)域，并提供疾病、治療靶點(diǎn)及相應(yīng)藥物的綜合信息平臺。通過借助上述3個數(shù)據(jù)庫，檢索高血壓疾病目前已被證實(shí)有治療作用的靶點(diǎn)，并借助Cytoscape3.6.1軟件繪制“疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”。

1.3 構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)及蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 通過Cytoscape3.6.1將“藥物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”與“疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”進(jìn)行合并，篩選出藥物作用靶點(diǎn)中與高血壓治療靶點(diǎn)重合的靶點(diǎn)，即關(guān)鍵靶點(diǎn)。String 數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)是一個在線搜索已知蛋白質(zhì)直接或間接相互作用的數(shù)據(jù)庫，可用于構(gòu)建蛋白互作(protein protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)[9]。借助String 數(shù)據(jù)庫，輸入上述關(guān)鍵靶點(diǎn)，物種限定設(shè)置為人類，隨后進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析。

1.4 GO功能注釋及KEGG通路富集 注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫(The Database for Annotation， Visualization and Integrated Discovery， DAVID)(https://david.ncifcrf.gov/)能對輸入的基因列表進(jìn)行分析，從而得到與之相關(guān)的基因本體(gene ontology，GO)功能注釋信息及基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG)通路信息[10]。在上述數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵靶點(diǎn)的基因信息，并對上述關(guān)鍵靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO功能注釋及KEGG通路富集。

2 結(jié) 果

2.1 蓮子心活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 經(jīng)TCMSP及BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索蓮子心活性成分，其中TCMSP數(shù)據(jù)庫共檢索出31種活性成分，BATMAN-TCM檢索出19種活性成分，剔除掉兩數(shù)據(jù)庫重復(fù)及無作用靶點(diǎn)的25種活性成分，最后篩選得到25種有效活性成分，共588個作用靶點(diǎn)，圖1為構(gòu)建的藥物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。表1中僅列出靶點(diǎn)數(shù)量排名前10位的活性成分。

圖1 蓮子心活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表1 蓮子心中靶點(diǎn)數(shù)量排前10位的活性成分

2.2 高血壓-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 經(jīng)檢索，TTD中共檢索出與高血壓相關(guān)的靶點(diǎn)57個，CTD中共檢索出與高血壓相關(guān)的靶點(diǎn)205個，DRUGBANK數(shù)據(jù)庫中共檢索出與高血壓相關(guān)的靶點(diǎn)172個，將上述靶蛋白輸入UniProt數(shù)據(jù)庫并剔除重復(fù)的靶點(diǎn)，最后共得到212個與高血壓相關(guān)的治療靶點(diǎn)。通過Cytoscape3.6.1構(gòu)建高血壓-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。詳見圖2。

圖2 高血壓-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 高血壓-靶點(diǎn)-蓮子心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將蓮子心-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)與高血壓-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行合并，共得到59個關(guān)鍵靶點(diǎn)，并構(gòu)建高血壓-靶點(diǎn)-蓮子心網(wǎng)絡(luò)(見圖3)。59個關(guān)鍵靶點(diǎn)通過String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)見圖4。

圖3 高血壓-靶點(diǎn)-蓮子心網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO功能注釋及KEGG通路富集 在DAVID中對上述關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集，P值越小意味著相關(guān)度越高，根據(jù)P值進(jìn)行排序。圖5為細(xì)胞定位、分子功能和生物學(xué)過程的GO功能注釋結(jié)果，圖6為KEGG通路富集結(jié)果，均依據(jù)P值大小，選擇P值最小即相關(guān)度最高的10位。圖7為作用于神經(jīng)遞質(zhì)通路關(guān)鍵靶點(diǎn)的細(xì)胞定位。

圖5 GO功能注釋

圖6 KEGG通路富集

圖7 多種神經(jīng)遞質(zhì)通路中關(guān)鍵靶點(diǎn)的細(xì)胞定位

3 討 論

借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，蓮子心中共篩選出25種活性成分及588個作用靶點(diǎn)，其中59個作用靶點(diǎn)與高血壓的治療靶點(diǎn)一致，即關(guān)鍵靶點(diǎn)。通過對上述59個關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能注釋及KEGG通路分析，按照P值進(jìn)行排名，P值越小排名越靠前，篩選出排名前10位的GO功能注釋及KEGG通路。通過對細(xì)胞學(xué)組分(cellular components，CC)、分子生物學(xué)功能(molecular function，MF)和生物學(xué)過程(biological process，BP)進(jìn)行功能富集分析，該59個關(guān)鍵靶點(diǎn)主要分布于質(zhì)膜、突觸前膜及突觸后膜等部位，具有調(diào)控電壓門控鉀、鈣通道活性及腎上腺素、乙酰膽堿、5-羥色胺等多種神經(jīng)遞質(zhì)受體活性的作用。提示蓮子心治療高血壓的機(jī)制可能涉及膜電位的去極化、血管平滑肌張力的調(diào)節(jié)、心肌舒張功能及心率的調(diào)節(jié)、多種神經(jīng)遞質(zhì)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程。通過對KEGG信號通路進(jìn)行

富集分析，蓮子心治療高血壓的機(jī)制可能涉及多種神經(jīng)遞質(zhì)通路、鈣信號通路、cGMP-PKG通路等。

高血壓的治療目的在于控制血壓及保護(hù)靶器官，血壓的持續(xù)升高往往涉及一個或多個生理調(diào)控系統(tǒng)失調(diào)。這些影響血壓的調(diào)控系統(tǒng)涉及共同的最終通路，包括中樞及交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活、血管的收縮、腎臟排鈉的調(diào)節(jié)等，此外炎癥與免疫也參與了血壓的調(diào)控過程[11-12]。鈣離子及內(nèi)皮細(xì)胞的參與在上述過程中起了重要作用，其中，鈣離子不僅可以通過調(diào)控血管平滑肌的張力參與血壓的調(diào)節(jié)，還可以通過改善心肌舒張功能從而起到保護(hù)心肌的作用；NO作為一種血管活性物質(zhì)主要由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，NO通過激活cGMP-PKG信號通路可使血管平滑肌舒張。而在早期關(guān)于蓮子心降壓或改善高血壓靶器官損害的基礎(chǔ)研究中，認(rèn)為其治療高血壓的機(jī)制可能是通過阻斷α腎上腺素受體及鈣拮抗[13]、清除氧自由基及抗氧化[14]、影響心肌肌漿

網(wǎng)鈣泵活力[15]，從而起到調(diào)控血壓和保護(hù)靶器官等作用，近年研究發(fā)現(xiàn)，蓮子心對血管內(nèi)皮也有保護(hù)作用[16]。這與通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測得到的關(guān)于蓮子心治療高血壓的可能機(jī)制是一致的。

中醫(yī)學(xué)將高血壓分為5個證型，其中肝陽上亢最為多見[17]，病人表現(xiàn)為頭暈、頭痛、面紅、脾氣急躁、易怒、舌紅苔黃、脈弦細(xì)，即大多數(shù)高血壓病人伴有急躁、易怒等情志的改變。將多巴胺、5-羥色胺等多種神經(jīng)遞質(zhì)通路上的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)主要是位于鈣離子通道上的各種受體亞基以及位于突觸后膜的5-羥色胺及多巴胺受體。5-羥色胺[18]和多巴胺[19]作為神經(jīng)系統(tǒng)重要神經(jīng)遞質(zhì)，它們均參與了情緒調(diào)控的生物過程。突觸前膜內(nèi)囊泡遞質(zhì)的釋放呈鈣離子依賴的量子式釋放，位于突觸前膜的鈣離子通道活性的改變可以影響5-羥色胺及多巴胺等遞質(zhì)的釋放并進(jìn)而調(diào)控情緒，而位于突觸后膜的5-羥色胺及多巴胺受體活性的改變也可以影響情緒[20]。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，蓮子心或許可以通過調(diào)控遞質(zhì)釋放及突觸后膜受體活性而改善高血壓病人急躁、易怒等情緒癥狀。這為后續(xù)探討蓮子心治療高血壓的同時是否能改善高血壓病人伴有的情緒癥狀提供了思考方向。