孫晶瑩，孫麗君，封 青，李亞萍，李 研，季延紅

(1.西安交通大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院 病原生物學與免疫學系，陜西 西安710061；2.陜西省人民醫(yī)院 中心實驗室；陜西 西安710068)

降鈣素原(procalcitonin)簡稱為PCT，是第11號染色體上(11p15,4)的單拷貝基因，是一種無激素活性的降鈣素的前肽物質[1]，由116個氨基酸組成，是分子量大約13 kD的一種炎性介質[2-4]，人體在正常生理狀態(tài)下，PCT由甲狀腺濾泡旁細胞合成分泌，因此在甲狀腺切除術和甲狀腺腫瘤等患者中存在PCT異位分泌的情況，CURRIE J等研究者認為 PCT 有可能是一種內源性非類固醇類抗炎物質[5,6]，正常人群體內的血漿 PCT 水平小于 0.1 ng/ml[7]。研究表明當機體被細菌感染時，細菌內毒素會誘導刺激機體產生大量的PCT，感染早期PCT的水平即會升高，重癥感染患者的PCT水平更高，而非細菌感染或過敏反應時PCT水平并不升高[8]。PCT的釋放是炎性反應過程中的一個重要環(huán)節(jié)，相比于其它的生物學標志物，PCT在細菌感染的預測方面更有優(yōu)勢，對細菌感染的肺炎診斷靈敏度為82%，特異性為84%[9]。2001年，PCT作為一種診斷指標被國際膿毒癥會議指定在膿毒癥診斷中使用[10-12]，總之PCT在感染性炎癥和指導抗菌藥物合理使用中均有重要的意義[13]，目前PCT已經在臨床檢測以及指導抗菌藥中廣泛應用，臨床上檢測PCT的主要方法是雙抗夾心免疫化學發(fā)光法，試劑盒的主要成分是能與PCT蛋白特異結合的PCT單克隆抗體，人血液中的PCT含量較低而且半衰期短，無法通過提取血液中的PCT獲得，因此本研究利用基因工程的方法，從TT細胞中獲得降鈣素原的全長基因，表達出PCT蛋白，并制備了單克隆抗體，利用ELISA和western鑒定抗體的特異性和穩(wěn)定性，并與臨床檢測試劑盒做了檢測對比，為后期研究PCT提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、質粒與菌株

鼠骨髓瘤細胞株SP/20、人甲狀腺髓伴癌細胞株(TT細胞)由陜西省人民醫(yī)院中心實驗室饋贈、感受態(tài)細胞BL21(DE3)、感受態(tài)細胞Transetta-T1、表達載體pEASY-E1購自北京全式金公司。

1.2 試驗動物

SPF 級 4-6 周齡 BALB/c 小鼠，購自西安交通大學醫(yī)學部動物中心。

1.3 主要實驗試劑

DNA Marker、Taq酶、His鎳柱均購于大連寶生物工程有限公司;質粒提取試劑盒購于北京天根生化科技有限公司;弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自sigma公司;HRP-羊抗鼠二抗，購自中杉金橋公司;小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒(SEK003-100)購自Sino Biological公司;降鈣素原檢測試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司。

1.4 pEASY-E1-PCT 質粒的構建

1.4.1PCT基因的獲取

表1 引物序列表

NCBI查找PCT的序列，利用prime 5.0軟件設計引物，序列如表1，培養(yǎng)TT細胞，提取RNA后反轉錄為CDNA，PCR擴增PCT的基因，擴增程序和體系如下：

PCR 反應體系 50 μl：cDNA模板4 μl，上下游引物各1 μl，dNTP 4 μl，primer star聚合酶0.5 μl，5×Buffer 10 μl，ddH2O 29.5 μl。

PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火 40 s，72℃延伸1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將獲得PCR 產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收。

1.4.2載體的連接

回收的PCT基因加A，回收產物7.5 μl，Ex Taq 1 μl，10×Ex Taq buffer 1 μl，dATP 0.5 μl，混勻后72℃ 10 min。產物與pEASY-E1載體連接，連接產物用于轉化Transetta-T1感受態(tài)細胞。取出感受態(tài)細胞，冰浴融化后，立即加入 5 μl 上述連接產物；混勻后冰浴25 min，42 ℃ 熱 激30 s，加入700 μl LB液體培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)1 h，取150 μl涂布于含氨芐青霉素 的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，次日挑取平板的24個單菌落培養(yǎng)后進行菌液PCR鑒定。

PCR 反應體系20 μl：菌液模板5 μl，上下游引物各0.5 μl，rTaq mix 10 μl，ddH2O 4 μl。

PCR反應條件：94℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58℃退火40 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

將獲得PCR 產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，挑選出了3個陽性菌液，送測序后經比對正確后提取質粒，陽性質粒命名為pEASY-E1-PCT。

1.5 重組蛋白的誘導表達

將重組質粒pEASY-E1-PCT轉化到Transetta(DE3) 感受態(tài)細胞中，Transetta(DE3)冰浴融化后，立即加入0.5 μl重組質粒；混勻后冰浴30 min，42℃熱激45 s，然后快速將管子移入冰浴中2 min，加700 μl LB液體培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)1 h，取150 μl涂布于含氨芐青霉素 的LB平板，挑取克隆重組菌pEASY-E1-PCT/DE3接種于含氨芐青霉素的LB液體中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600為0.5-0.6時，加入誘導劑IPTG(終濃度為0.33 mmol·L-1)進行誘導表達，誘導前收取1 ml菌作為對照，誘導6 h后收集菌體，利用SDS-PAGE進行鑒定，將表達蛋白命名為MBP-PCT，重組菌大量誘導表達后利用His鎳柱純化，純化后透析濃縮用以制備單克隆抗體。

1.6 PCT單克隆抗體的制備

用重組蛋白免疫6-8周雌性BALB/C小鼠，抗原量為50 μg/只，用佐劑乳化，方法參考文獻[14]，按常規(guī)方法制備單克隆抗體腹水。

1.7 PCT單克隆抗體的生物學特性分析

(1)單抗亞型鑒定：用小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒進行亞型測定；(2)單克隆抗體的純化：辛酸-硫酸銨鹽析沉淀法，先用正辛酸除去雜蛋白，再用飽和硫酸銨沉淀抗體，用PBS混勻后透析除鹽，獲得純化后的抗體，經Nanodrop2000測定2株抗體的蛋白含量、ELISA 法測定抗體效價。(3)效價測定 ：ELISA法測定純化后抗體效價；(4)抗體交叉鑒定：包被抗原解脲支原體、沙眼衣原體、肺炎支原體、肺炎衣原體、腺病毒、合胞病毒、2009年H1N1、原核表達EV71-VP1抗原及降鈣素原，包被過夜，洗板后加入單克隆抗體上清原液，SP20培養(yǎng)上清為陰性對照，37℃孵育1 h；PBST洗板3次，加入1∶2500稀釋的羊抗鼠酶標二抗，37℃孵育1 h；PBST洗板3次，以TMB 底物顯色，2M硫酸終止顯色，TMB在過氧化酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色，用酶標儀測定 D450 nm值；(5)辣根過氧化物酶(HRP)標記PCT-5和PCT-8單抗，用ELISA檢測酶標抗體的稀釋度。

1.8 PCT單克隆抗體的應用

收集檢驗科中性粒細胞高的患者的血清及正常血清，雙抗夾心檢測血清標本，包被純化的PCT-5抗體，二抗為PCT-5對應的HRP酶標抗體，檢測樣本血清中PCT含量，同時用購買的降鈣素原試劑盒做檢測，比較制備抗體的效果。

1.9 統(tǒng)計學分析

使用SPSS.21統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據分析，以P<0.01為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 重組質粒pEASY-E1-PCT的構建

2.1.1PCR擴增得到了目的基因片段，片段大小435 bp，擴增結果如下圖1，經載體構建后獲得質粒，質粒的電泳結果如下圖2。

圖1 PCR擴增圖 (1,2均為PCR產物)

圖2 質粒電泳圖

2.1.2質粒測序結果

將PCR鑒定陽性的質粒送北京華大基因進行測序，經與DNAMAN比對后測序結果正確，序列如下：

CATGGATCCATGGGCTTCCAAAAGTTCT

CCCCCTTCCTGGCTCTCAGCATCTTGGTCCTG

TTGCAGGCAGGCAGCCTCCATGCAGCACCAT

TCAGGTCTGCCCTGGAGAGCAGCCCAGCAGA

CCCGGCCACGCTCAGTGAGGACGAAGCGCGC

CTCCTGCTGGCTGCACTGGTGCAGGACTATG

TGCAGATGAAGGCCAGTGAGCTGGAGCAGG

AGCAAGAGAGAGAGGGCTCCAGCCTGGACA

GCCCCAGATCTAAGCGGTGCGGTAATCTGA

GTACTTGCATGCTGGGCACATACACGCAGG

ACTTCAACAAGTTTCACACGTTCCCCCAAAC

TGCAATTGGGGTTGGAGCACCTGGAAAGAA

AAGGGATATGTCCAGCGACTTGGAGAGAGA

CCATCGCCCTCATGTTAGCATGCCCCAGAAT

GCCAACTAA

2.2 重組蛋白的表達結果

15%的SDS-PAGE電泳顯示，利用IPTG誘導后的目的蛋白大量表達，分子量約為16 kD，結果如圖3所示。

圖3 重組質粒誘導表達結果

2.3 PCT單克隆抗體的制備及鑒定

獲得2株抗降鈣素原的單克隆抗體，分別為PCT-5、PCT-8。經亞型測定試劑盒測定，PCT-5單抗的亞型為IgG2b，PCT-8單抗的亞型為IgG1，均為κ鏈,見表2。

2.4 PCT單克隆抗體的反應特性鑒定

通過包被抗原解脲支原體、沙眼衣原體、肺炎支原體、肺炎衣原體、腺病毒、合胞病毒、2009年H1N1、原核表達EV71-VP1抗原及降鈣素原，鑒定單克隆抗體的反應性，結果如表3所示，結果表明，制備的PCT單克隆抗體特異性強，僅與降鈣素原抗原反應，其余抗原結果均為陰性。

表2 單克隆抗體的鑒定

表3 PCT mAb反應性鑒定

2.5 HRP標記PCT-5單克隆抗體

利用間接ELISA方法檢測HRP標記的PCT-5單克隆抗體的最佳稀釋濃度，酶標PCT-5的最佳稀釋度為104，如圖4所示。

圖4 ELISA檢測HRP酶標抗體的最佳稀釋濃度

2.6 PCT單克隆抗體的應用

選擇PCT-5單抗株進行樣本檢測，雙抗夾心ELISA法檢測收集的臨床樣本，與商品化試劑盒進行結果對照，PCT-5單抗結果陽性率為74%，商品試劑盒陽性率為78%，二者方法檢測一致率為96%，經SPSS21軟件統(tǒng)計學分析，兩種檢測結果差異不具有統(tǒng)計學意義，P>0.05,見表4。

表4 PCT-5單抗與商品試劑盒檢測樣本比較結果(P>0.05)

3 討論

PCT的釋放是炎癥反應過程的一個重要信號環(huán)節(jié)，PCT的含量指標與IL-6、IL-8、IL-10等相比，對嚴重細菌感染及膿毒癥的早期確診更靈敏和特異。大量的研究資料顯示，細菌感染性疾病的發(fā)生發(fā)展和血液中PCT含量呈正相關，即隨著感染的嚴重程度，體內的PCT由低到高，因此PCT是全身炎癥反應的早期診斷指標，同時PCT在指導抗菌藥物合理使用中也有重要意義[13]。因此PCT具有非常重要的臨床診斷及研究價值。由于PCT在血液中存在的半衰期較短，從血液中來提取PCT蛋白很難實現(xiàn)，同時化學合成蛋白比較高，在實際工作中多考慮表達蛋白來研究。

本文選擇培養(yǎng)TT細胞提取mRNA后進行反轉錄為cDNA后通過PCR擴增PCT的全長基因序列，避免了部分片段表達導致其蛋白信息的丟失，通過原核表達PCT蛋白并制備其單抗研究其意義，選擇原核表達載體pEASY-E1，可以快速平端克隆PCR產物，其N端具有6×His蛋白純化標簽，后期方便純化，克隆效率高，操作簡單，表達量高，利用克隆的表達載體表達了目的重組蛋白，鑒定純化后制備單克隆抗體，得到兩株特異的單克隆抗體株，效價高達104和105，并將得到的單克隆抗體株包被板子檢測臨床樣本血清中的PCT含量，與商品化的試劑盒進行檢測結果比較，結果顯示二者檢測方法的一致率為96%，基本一致，但是對于血清中PCT含量較低的樣本，我們制備的單抗相比于商品化靈敏度稍低一點，后期工作將對檢測線及靈敏度進行優(yōu)化研究，為后續(xù)的研究工作做好鋪墊，本研究獲得的重組PCT蛋白和單克隆抗體為后續(xù)研究及檢測方法的研究提供了有效依據。