陳海念，馮蓉,2，楊勝竹，曹本福,3，文明江，劉麗,2*，陸引罡,2,3

（1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)新型肥料資源與技術(shù)研究所，貴陽(yáng) 550025；3.貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025）

以化學(xué)農(nóng)藥為主導(dǎo)的植物病害防治策略附帶的農(nóng)藥殘留超標(biāo)、病原菌抗藥性增強(qiáng)及生態(tài)平衡被破壞等問(wèn)題日益凸顯[1-3]，而微生物防治表現(xiàn)出的無(wú)污染、無(wú)公害、長(zhǎng)效性、處理費(fèi)用低廉等優(yōu)勢(shì)[4-7]，使得生物防治技術(shù)成為控制植物病害的最佳選擇之一[8-9]。目前，許多有益微生物已應(yīng)用于植物病害防治中[10-12]，包括真菌、細(xì)菌和一系列放線菌等[13]。生防菌種類不同，其生物防治的機(jī)制也不相同，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）B-916產(chǎn)生的抗真菌蛋白物質(zhì)通過(guò)核糖核酸酶和凝結(jié)作用抑制水稻稻瘟病、菌核病、紋枯病及灰霉病病原菌菌絲的生長(zhǎng)，從而防治水稻多種病害[14]；木霉菌（Trichodermaspp.）可在其他微生物上纏繞生長(zhǎng)，同時(shí)產(chǎn)生抗菌類物質(zhì)來(lái)抑制該微生物的活性，降低病原微生物的致病能力，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。以多粘芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）SQR-21制備的生物有機(jī)肥施用于香蕉根圍土壤中，可提高香蕉植株根尖的蛋白類抗菌物質(zhì)幾丁質(zhì)酶的活性，顯著促進(jìn)香蕉植株生長(zhǎng)，降低香蕉枯萎病的發(fā)病指數(shù)[15]。HELMY等[16]發(fā)現(xiàn)，從熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）中分離純化獲得的嗜鐵素可有效遏制煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、黃曲霉（Aspergillus flavus）等多種病原菌的生長(zhǎng)。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）FZB42產(chǎn)生的聚酮化合物對(duì)由梨火疫病病原菌（Erwinia amylovora）引起的梨火疫病具有良好的防治效果[17]；趙青云等[18]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌Y-IVI能促進(jìn)香草蘭生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)減少尖孢鐮刀菌的數(shù)量，降低連作障礙，并可產(chǎn)生鐵載體、吲哚乙酸等物質(zhì)，促進(jìn)甜瓜生長(zhǎng)。

上述研究為生防菌更好地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供了一定的參考依據(jù)，展現(xiàn)出生防菌良好的農(nóng)業(yè)應(yīng)用前景。生防菌株的種屬確定、可培養(yǎng)性、發(fā)酵效率及其抑菌效果等是保證生物防治效果的前提，也是決定其能否從實(shí)驗(yàn)室走向田間的關(guān)鍵。培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件皆會(huì)明顯影響微生物的生長(zhǎng)發(fā)育和抑菌活性物質(zhì)的形成[19]；而通常，欲提高生防菌抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量，則應(yīng)先保證其細(xì)胞產(chǎn)量[20]。鑒于此，我們對(duì)課題組前期研究篩選所得的1株對(duì)草莓灰霉病菌（strawberry gray mold）具有較佳拮抗作用的菌株F11開(kāi)展了進(jìn)一步研究，測(cè)試了該菌株對(duì)多種常見(jiàn)病原菌的抑菌效果，并結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化方法、16S rRNA及gyrB的分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行了鑒定，最后對(duì)該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化篩選。研究結(jié)果可為挖掘其作為植物病害防治的潛在資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：F11菌株，由貴州大學(xué)新型肥料資源與技術(shù)研究所在前期研究時(shí)從草莓根際土壤中分離篩選得到，對(duì)草莓灰霉病菌具有拮抗性能。

供試病原菌：水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、獼猴桃葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、煙草黑脛病菌（Phytophthora parasiticavar.）、煙草炭疽病菌（Colletotrichum nicotianaeAv.）、樟樹(shù)膠孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosp orioides）、高粱斑點(diǎn)病菌（Pseudomonas syringaepv.syringaeVan Hall）、玉蘭炭疽病菌（Colletotrchum magnoliae camara）、核盤菌（Sclerotiniasclerotiorum）、禾谷炭疽菌（Colletotrichum graminicolaCesati Wilson）、玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）、辣椒炭疽菌（Colletotrichum capsici）、煙草赤星病菌[Alternaria alternata(Freis)Keissler]共12種病原菌，均為貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)肉湯（nutrient broth,NB）液體培養(yǎng)基：3.00 g牛肉膏，10.00 g蛋白胨，5.00 g NaCl，2.00 g/L MgCl2，加水至1 000 mL，pH 7.0，高壓（1×105Pa）滅菌30 min，冷卻備用。

NB固體培養(yǎng)基：在NB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入瓊脂 20.0 g，高壓（1×105Pa）滅菌 30 min，冷卻備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯（去皮切塊，煮沸0.5 h，紗布過(guò)濾），20 g蔗糖，20 g瓊脂，加水至1 000 mL，pH自然（7.0），高壓（1×105Pa）滅菌30 min，冷卻后倒平板，備用。

1.3 種子菌液的制備

取一環(huán)F11菌苔于NB固體培養(yǎng)基上畫(huà)線，在30℃恒溫培養(yǎng)箱（GXZ-258A，浙江省寧波江南儀器廠）中培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落接種于NB液體培養(yǎng)基中，于30℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)18 h（經(jīng)前期F11生長(zhǎng)曲線確定），獲得F11種子菌液。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 菌株F11對(duì)病原菌的抑菌效果分析

采用經(jīng)典的平板對(duì)峙培養(yǎng)法，觀察菌株F11的拮抗情況并測(cè)定其對(duì)各病原菌的抑菌圈大小。具體方法為：將直徑為7.5 mm的圓形病原菌苔菌塊置于PDA平板的中央，在距平板中心2.0 cm處的4個(gè)對(duì)角線上接種F11拮抗菌，每個(gè)處理重復(fù)3次；另在PDA平板中心接種病原真菌作空白對(duì)照，在28℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)6～8 d，測(cè)定抑菌圈大小。

1.4.2 菌株F11的鑒定

1.4.2.1 菌株F11的形態(tài)特征和生理生化特性鑒定

將稀釋的菌株發(fā)酵液均勻涂布于NB固體培養(yǎng)基平板上，放入恒溫培養(yǎng)箱，28℃條件下恒溫培養(yǎng)2 d，出現(xiàn)單菌落后觀察菌落形狀、顏色、邊緣、表面、隆起形狀、透明度等，并在Leica DM500電子顯微鏡（德國(guó)徠卡公司）下觀察細(xì)胞的形狀、結(jié)構(gòu)、大小等。菌株的形態(tài)特征和生理生化特性鑒定參照2012年修訂的《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》（第二版）[21]。

1.4.2.2 菌株F11的16S rRNA和gyrB基因鑒定

菌株DNA的提?。喝?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株F11菌液，以1.2×104r/min離心5 min，收集1.5 mL上清液，將菌體懸浮于400 μL提取液[10 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）]中，pH 8.0，加入100 μL終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的蛋白酶K和500 μg/mL的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS）溶液。將其輕輕混勻后，于37℃條件下水浴1 h，再在65℃條件下水浴1 h。加入600 μL的酚-三氯甲烷-異戊醇，室溫下顛倒混勻后以1.2×104r/min離心10 min，將上清液移入1.5 mL離心管，重復(fù)該步驟。向含有DNA的上清液水相中加入1/10體積的3 mol/L乙酸鈉（pH 5.5）和2倍體積的無(wú)水乙醇，輕顛混勻后于－20℃條件下沉淀1 h。以1.2×104r/min離心15 min，棄上清液。用70%無(wú)水乙醇洗滌沉淀，以1.2×104r/min離心15 min，棄上清液，風(fēng)干。用 50～150 μL TE 緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl與1 mmol/L EDTA的混合緩沖液，pH 8.0）溶解基因組DNA，在－20℃條件下儲(chǔ)存，備用。

菌株DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增：以菌株F11基因組DNA為模板進(jìn)行16S rRNA和gyrB基因擴(kuò)增。16S rRNA引物序列如下。27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。gyrB基因引物序列[22]如下。UP-1：5′-GAAGTCATCATG ACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′；UP-2r：5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTC NACRTCNGCRTCNGTCAT-3′。PCR擴(kuò)增體系為：10 μmol/L正反向引物各1 μL，天根2×TaqPCR混合液12.5 μL，模板DNA 2 μL，用無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至25 μL。其中天根2×TaqPCR混合液包括：0.1 U/μLTaq聚合酶、各 500 μmol/L dNTP、20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3）、100 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2及其他穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4 min；98 ℃變性10 s，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。將16S rRNA和gyrB基因擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行測(cè)序分析，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）與GenBank中的序列對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，從分子水平上對(duì)菌株F11進(jìn)行鑒定。

1.4.3 培養(yǎng)基配方優(yōu)化

采用L16（43×26）的正交設(shè)計(jì)對(duì)菌株F11培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化。其中，4水平的3因素分別為牛肉膏、蛋白胨、NaCl；2水平的6因素分別為葡萄糖、Mn、Mo、Fe、B、Mg，共設(shè)置1～16號(hào)處理（表1）。以NB培養(yǎng)基（處理17）作為空白對(duì)照。各處理按1%接種量接種后，在30℃、150 r/min條件下振蕩18 h，采用T6-XSJ紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）測(cè)定可表征菌懸液細(xì)胞濃度的吸光度值D600nm[23-24]。每個(gè)處理重復(fù)5次，完全隨機(jī)排列。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果分析各試驗(yàn)因素的適宜水平。

1.4.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

對(duì)菌株F11進(jìn)行不同初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、不同培養(yǎng)溫度（25、30、33、35、40 ℃）和不同振蕩速率（100、150、170、180 r/min）的發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)。各處理的F11種子液接種量均為1%。其中，不同初始pH試驗(yàn)的培養(yǎng)溫度為30℃，振蕩速率為150 r/min；不同培養(yǎng)溫度試驗(yàn)的培養(yǎng)基pH為優(yōu)選確定的pH，振蕩速率為150 r/min；不同振蕩速率試驗(yàn)的培養(yǎng)基pH為優(yōu)選確定的pH，培養(yǎng)溫度為優(yōu)選確定的溫度。各處理重復(fù)5次，完全隨機(jī)排列。振蕩培養(yǎng)18 h，測(cè)定發(fā)酵液吸光度值D600nm，由此確定菌株F11的最佳培養(yǎng)基的初始pH、培養(yǎng)溫度和振蕩速率的優(yōu)化水平。

表1 L16（43×26）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 1 Design of L16(43×26)orthogonal array experiment

1.4.5 優(yōu)化效果鑒定

按1%接種量將菌株F11接種于優(yōu)選配方培養(yǎng)基上，在最佳發(fā)酵條件下振蕩培養(yǎng)18 h，獲得從對(duì)數(shù)期剛轉(zhuǎn)入穩(wěn)定期的菌株F11發(fā)酵液，測(cè)定發(fā)酵液在600 nm處的吸光度值和活菌數(shù)。以NB液體培養(yǎng)基為對(duì)照，鑒定優(yōu)化效果。

1.5 數(shù)據(jù)分析

相對(duì)抑制率=（對(duì)照菌落直徑/mm－處理菌落直徑/mm）/（對(duì)照菌落直徑/mm－7.5 mm）×100%。式中，處理菌落的初始直徑為7.5 mm。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010整理并作圖，采用DPS 14.0進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)方差分析，采用MEGA 6.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株F11對(duì)多種病原菌的抑制作用

經(jīng)平板對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)，對(duì)病原菌生長(zhǎng)直徑進(jìn)行測(cè)定并采用t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)菌株F11拮抗處理后病原菌生長(zhǎng)受到了明顯抑制，可見(jiàn)F11對(duì)多種病原菌的生長(zhǎng)具有拮抗性能（表2）。其中：菌株F11對(duì)核盤菌的抑制作用最強(qiáng)，相對(duì)抑制率達(dá)到100.00%；其次為玉米大斑病菌，菌株F11對(duì)其的相對(duì)抑制率為94.74%，且對(duì)煙草炭疽病菌、玉蘭炭疽病菌和獼猴桃葡萄座腔菌等病原菌的抑制率均達(dá)79.88%以上。由此說(shuō)明，F(xiàn)11具有高效、廣譜的抑菌效果，表現(xiàn)出良好的生防應(yīng)用潛能。

2.2 菌株F11的形態(tài)特征

如圖1A所示,菌株F11菌落呈圓形，邊緣不整齊，呈鋸齒狀，表面干燥，有褶皺，無(wú)黏性，不透明，乳白色。光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)該菌株細(xì)胞為短桿狀（部分橢圓狀），有芽孢形成，兩端鈍圓，很少成鏈，成單或是成短鏈排列，初步鑒定為芽孢桿菌屬（圖1B）。

表2 菌株F11對(duì)12種病原菌的抑制作用Table 2 Inhibitory effects of strain F11 on 12 pathogens

圖1 菌株F11的形態(tài)Fig.1 Morphology of strain F11

2.3 菌株F11的生理生化特征

生理生化鑒定結(jié)果（表3）表明，菌株F11經(jīng)革蘭氏染色呈陽(yáng)性，在1%～8%NaCl處理?xiàng)l件下均可生長(zhǎng)，在鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、甲基紅反應(yīng)、硫化氫實(shí)驗(yàn)中結(jié)果為陰性，在β-半乳糖苷酶、接觸酶、氧化酶、脲酶、精氨酸雙水解酶、淀粉水解、明膠水解、酪素水解、硝酸鹽還原、檸檬酸生長(zhǎng)、50℃生長(zhǎng)、VP（Voges-Proskauer）反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)中結(jié)果為陽(yáng)性。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，菌株F11的生理生化特征與其他4種解淀粉芽孢桿菌基本一致。結(jié)合菌株F11的菌落及細(xì)胞形態(tài)特征，初步擬定菌株F11為解淀粉芽孢桿菌。

2.4 菌株F11的分子鑒定

在細(xì)菌的進(jìn)化過(guò)程中，16S rRNA基因和gyrB基因具有較高的保守性，16S rRNA平均每5 000萬(wàn)年堿基的替換變化率為1%，而gyrB基因每100萬(wàn)年堿基的替換變化率為0.7%～0.8%。gyrB可彌補(bǔ)16S rRNA序列無(wú)法區(qū)分近緣種的缺陷，能更好地區(qū)分近似種。因此，結(jié)合2種基因擴(kuò)增測(cè)序方式可使菌株的種屬鑒定更為準(zhǔn)確。經(jīng)測(cè)序，菌株F11的16S rRNA及gyrB基因序列長(zhǎng)度分別為1 457 bp和879 bp。測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，其識(shí)別號(hào)分別為8TCWE8SN015和8TE5X4BT014，選取相似度較高的序列及大腸埃希菌等相似度較低的菌株序列為外群，采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）顯示：菌株F11與解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciensFito_F321（序列號(hào)：MG836692.1）在同一分支上，Blast比對(duì)相似性高達(dá)99.79%；在gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）上，菌株F11與解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciensRx-35（序列號(hào)：JN086142.1）在同一分支上，Blast比對(duì)相似性高達(dá)99.89%。結(jié)合菌株形態(tài)和生理生化特征，確定菌株F11為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）。

表3 菌株F11與其他解淀粉芽孢桿菌生理生化鑒定結(jié)果對(duì)比Table 3 Comparison of physiological and biochemical identification results of strain F11 with other Bacillus amyloliquefaciens

圖2 16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rRNA

圖3 gyrB基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of gyrB gene

2.5 基于NB培養(yǎng)基的配方優(yōu)化

如圖4所示，菌落F11菌懸液D600nm值在處理間存在顯著差異（P＜0.05），其中正交試驗(yàn)處理12～14的D600nm值均顯著高于NB培養(yǎng)基（處理17）的D600nm值（0.59），以處理12的D600nm值（1.41）為最高。

圖4 L16（43×26）正交試驗(yàn)各處理及NB培養(yǎng)基處理的F11菌懸液D600 nm值比較Fig.4 Comparison of D600 nmvalues of F11 suspension under L16(43×26)orthogonal test treatments and NB medium treatment

圖5與表4顯示，在各因子中除B和Fe的2水平間不存在顯著性差異外，其余7個(gè)因子水平間差異顯著（P＜0.05）。其中，Mn的添加顯著降低了D600nm值，其余因子均表現(xiàn)出正效應(yīng)。正效應(yīng)因子中，以蛋白胨、NaCl、葡萄糖、牛肉膏效應(yīng)較大。值得一提的是，因子牛肉膏、蛋白胨及NaCl的D600nm值總體上隨用量的增加而增加，但NaCl水平3顯著低于水平2，這可能與其他因子的交互作用產(chǎn)生效應(yīng)混雜有關(guān)[29]。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，各因子優(yōu)選量的確定結(jié)果見(jiàn)表4。

當(dāng)?shù)刂饕N植玉米、水稻、果樹(shù)等作物。四川是農(nóng)業(yè)大省，有西南地區(qū)“尿罐子”之稱?；蕵I(yè)是支農(nóng)惠農(nóng)的戰(zhàn)略性資源產(chǎn)業(yè)，化肥業(yè)仍將得到大力支持，當(dāng)?shù)鼗市袠I(yè)總體發(fā)展趨勢(shì)良好。但煤化工項(xiàng)目水耗高、環(huán)保壓力大，煤炭同樣存在供應(yīng)和價(jià)高問(wèn)題，且設(shè)備改造成本較大。受環(huán)保條例影響，很多工廠被勒令停產(chǎn)，何時(shí)開(kāi)工還未知，這或?qū)⒗瓌?dòng)化肥價(jià)格上漲。

圖5 F11菌懸液D600 nm值在各正交試驗(yàn)因子水平間的比較Fig.5 Comparison of D600 nmvalues of F11 suspension in the levels of various factors in the orthogonal test

表4 各正交試驗(yàn)因子的極差、P值與優(yōu)選量Table 4 Range,P value and optimal dosage for each factor in the orthogonal test

2.6 菌株F11發(fā)酵條件優(yōu)選

2.6.1 不同初始pH對(duì)菌株F11生長(zhǎng)的影響

按表4各因子優(yōu)選量配制不同初始pH的優(yōu)化配方培養(yǎng)基及NB液體培養(yǎng)基，以對(duì)F11進(jìn)行對(duì)比培養(yǎng)。不同pH條件下2種培養(yǎng)基的F11菌懸液D600nm值如圖6所示：D600nm值隨pH升高均呈先升高后降低的趨勢(shì)，方差分析表明，不管是優(yōu)化配方培養(yǎng)基還是NB液體培養(yǎng)基，pH對(duì)菌株F11的D600nm值均存在顯著性影響；優(yōu)化培養(yǎng)基下菌株F11的D600nm值均高于NB液體培養(yǎng)基（pH 8.0除外），且2類培養(yǎng)基的D600nm值均在pH 7.0時(shí)達(dá)到最高。當(dāng)pH為7.0～8.0時(shí)D600nm值均逐漸降低，在pH 8.0時(shí)降到最低：說(shuō)明該菌株較適宜生長(zhǎng)于中性環(huán)境而不適宜生長(zhǎng)在堿性環(huán)境中。上述結(jié)果表明，菌株F11最適宜生長(zhǎng)在初始pH為7.0的環(huán)境中，且基于優(yōu)化配方的培養(yǎng)基對(duì)菌株F11的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)效果。

圖6 不同初始pH對(duì)菌株F11生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of different initial pH on the growth of strain F11

2.6.2 基于優(yōu)選pH的不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株F11生長(zhǎng)的影響

如圖7所示，不管是優(yōu)化配方還是NB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度對(duì)菌株F11的生長(zhǎng)都存在顯著影響（P＜0.05）。在25～40℃之間，優(yōu)化配方D600nm值和NB液體培養(yǎng)基的變化趨勢(shì)一致，且各溫度下都以優(yōu)化配方的D600nm值較高。就優(yōu)化配方而言，D600nm值呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為30℃時(shí)D600nm值達(dá)到最高，為1.271，此時(shí)NB液體培養(yǎng)基的D600nm值亦最高，但僅為0.557，二者間達(dá)極顯著差異水平（P＜0.01）；當(dāng)溫度為33～40℃時(shí)，D600nm值顯著下降；25℃時(shí)D600nm值也顯著低于30℃時(shí)的。由上可見(jiàn)，當(dāng)初始pH為7.0時(shí)，優(yōu)化配方發(fā)酵菌株F11的適宜溫度為30℃。

圖7 不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株F11的影響Fig.7 Effects of different incubation temperatures on strain F11

2.6.3 基于優(yōu)選pH和溫度的不同振蕩速率對(duì)菌株F11生長(zhǎng)的影響

菌株F11為好氧菌，因此培養(yǎng)基中溶氧量的多少會(huì)影響F11的生長(zhǎng)。通過(guò)控制發(fā)酵過(guò)程中的振蕩速率調(diào)節(jié)溶氧量后，菌株F11的生長(zhǎng)差異見(jiàn)圖8。在優(yōu)選pH和優(yōu)選溫度條件下，優(yōu)化配方培養(yǎng)基較NB液體培養(yǎng)基顯著提高了F11菌懸液的D600nm值。在100～180 r/min之間，優(yōu)化配方的D600nm值和NB液體培養(yǎng)基的變化趨勢(shì)基本一致。就優(yōu)化配方而言，D600nm值先上升后下降，在振蕩速率為150 r/min時(shí)D600nm值達(dá)到最大，為1.272（此振蕩速率下NB液體培養(yǎng)基F11菌懸液的D600nm值亦最大，為0.561）；振蕩速率為170～180 r/min時(shí)D600nm值顯著下降。上述結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明該優(yōu)化配方有利于促進(jìn)F11的生長(zhǎng)繁殖，且在初始pH 7.0、優(yōu)選溫度30℃條件下，優(yōu)化配方發(fā)酵菌株F11的適宜振蕩速率為150 r/min。

圖8 不同初始振蕩速率對(duì)菌株F11生長(zhǎng)的影響Fig.8 Effect of different initial oscillation rates on the growth of strain F11

2.6.4 F11菌株發(fā)酵優(yōu)化對(duì)活菌數(shù)的影響

如圖9所示，基于上述最優(yōu)發(fā)酵條件（初始pH 7.0、溫度30℃、振蕩速率150 r/min），通過(guò)平板計(jì)數(shù)得優(yōu)化培養(yǎng)基中活菌數(shù)為4.67×109CFU/mL，NB液體培養(yǎng)基中活菌數(shù)為1.24×109CFU/mL，優(yōu)化培養(yǎng)基中的活菌數(shù)為NB液體培養(yǎng)基中的3.76倍，二者間達(dá)極顯著差異（P＜0.01）。由此可見(jiàn)，優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株F11的效果優(yōu)于NB液體培養(yǎng)基。

圖9 優(yōu)化配方和NB液體培養(yǎng)基中F11活菌數(shù)比較Fig.9 Comparison of viable cells of strain F11 between optimized formula and NB liquid medium

3 討論

菌株的屬種確定可使其更好地應(yīng)用于生物病害的防治之中。本研究中，根據(jù)菌株F11形態(tài)特征和生理生化特征，參照文獻(xiàn)[21]初步確定該菌株為芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。為了保證生防菌F11鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究進(jìn)一步采用16S rRNA[30-31]和gyrB基因[22,32-33]相結(jié)合的生物學(xué)方法對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定分析，并基于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明：該菌株與解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciensFito_F321和解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciensRx-35序列的相似性分別達(dá)到99.79%和99.89%，二者形態(tài)特征、生理生化特征鑒定結(jié)果一致，確定菌株F11為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）。

芽孢桿菌屬（Bacillus）是一類能夠在不利條件下產(chǎn)生特殊抵抗力芽孢和眾多抗菌物質(zhì)的細(xì)菌[34]，其生長(zhǎng)速度快，對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，在生物防治中應(yīng)用廣泛[35]。作為芽孢桿菌屬中的一種，解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）可產(chǎn)生抗生素等次級(jí)代謝物質(zhì)，以抑制有害病原物的生長(zhǎng)或直接殺滅病原物；此外，還可產(chǎn)生一系列對(duì)病原菌抑制起到重要作用的胞外水解酶[35-36]，是一種重要的生防菌種。本研究對(duì)解淀粉芽孢桿菌F11（B.amyloliquefaciensF11）的抑菌效果和廣譜性進(jìn)行了探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：除可防治草莓灰霉病外，該菌株對(duì)水稻稻瘟病菌、核盤菌等12種常見(jiàn)的供試病原菌都有較高的抑制活性，相對(duì)抑制率均在79.88%以上，其中以對(duì)核盤菌的抑制率為最高，達(dá)100%?？梢?jiàn)B.amyloliquefaciensF11具有高效、廣譜的抑菌效果。

培養(yǎng)基配方正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果顯示：牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、NaCl、Mg、Mo對(duì)菌株F11的生長(zhǎng)繁殖具有顯著正效應(yīng)，Mn具有顯著負(fù)效應(yīng)，B和Fe的添加對(duì)菌株F11未表現(xiàn)出顯著性影響。劉麗等[23]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)枯草芽孢桿菌F2（B.subtilisF2）而言，Mo的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)不顯著，Mg、Mn、B和Fe都具有正效應(yīng)。可見(jiàn)，盡管枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）皆是芽孢桿菌屬的成員[37]，但影響二者生長(zhǎng)的礦質(zhì)養(yǎng)分因子仍存在較大差異。此外，本試驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)正交設(shè)計(jì)，確定菌株F11發(fā)酵的最優(yōu)配方為：3.00 g/L牛肉膏、10.00 g/L蛋白胨、5.00 g/LNaCl、3.00 g/L葡萄糖、2.00 g/LMgCl2。

培養(yǎng)基的初始pH、培養(yǎng)溫度和振蕩速率皆是影響微生物生長(zhǎng)代謝的重要環(huán)境因子，適宜的培養(yǎng)環(huán)境可極大地促進(jìn)菌株生長(zhǎng)，提高產(chǎn)胞能力[38]。本研究在正交設(shè)計(jì)的優(yōu)選配方基礎(chǔ)上進(jìn)行了培養(yǎng)條件的優(yōu)選試驗(yàn)，結(jié)果表明：培養(yǎng)菌株F11不適合在堿性環(huán)境中生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)pH為7.0；發(fā)酵溫度在30℃時(shí)，菌株生長(zhǎng)良好，不適宜在35～40℃條件下生長(zhǎng)；振蕩速率以150 r/min為宜。基于優(yōu)化配方、pH、培養(yǎng)溫度及振蕩速率的發(fā)酵培養(yǎng)條件，經(jīng)平板計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，該菌株的活菌數(shù)達(dá)4.67×109CFU/mL，極顯著高于NB液體培養(yǎng)基中的（P＜0.01）?？紤]夏季為植物病害的高發(fā)期，將其馴化以適應(yīng)高溫環(huán)境或在高溫環(huán)境下能較好地產(chǎn)生抑菌物質(zhì)是下一步研究的方向。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，生防菌F11對(duì)水稻稻瘟病菌、核盤菌等12種常見(jiàn)病原菌具有較佳的拮抗性能，抑制率均達(dá)79.88%以上，表現(xiàn)出高效、廣譜的抑菌效果。經(jīng)生理生化和基因測(cè)序分析鑒定，確定菌株F11為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）。采用正交設(shè)計(jì)，確定菌株F11發(fā)酵的優(yōu)化配方為：3.00 g/L牛肉膏、10.00 g/L蛋白胨、5.00 g/L NaCl、3.00 g/L葡萄糖、2.00 g/L MgCl2。單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明：基于優(yōu)化配方，該菌株培養(yǎng)的最佳初始pH為7.0、最適溫度為30℃、最宜振蕩速率為150 r/min；此外，通過(guò)平板計(jì)數(shù)顯示，基于上述優(yōu)化培養(yǎng)基配方、優(yōu)化發(fā)酵條件，其活菌數(shù)相較于NB液體培養(yǎng)基顯著提高，為4.67×109CFU/mL。研究結(jié)果為該菌株應(yīng)用于植物病害防治提供了理論依據(jù)。