張婉迎，白雪媛，楊俊杰，韓冰，張巍，王思明

（長春中醫(yī)藥大學，吉林長春130117）

鐵皮石斛為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）的干燥莖，為我國傳統(tǒng)名貴藥材，享有“中華九大仙草”之首的美譽，目前作為一種常見的保健品被人們廣泛接受[1]。古籍中多有其“厚腸胃”“平胃氣”“清胃熱”“健脾開胃”等論述[2-3]，且諸多學者認為鐵皮石斛多糖（polysaccharides from Dendrobium officinale，DOP）對胃黏膜具有保護作用[4-5]，但鐵皮石斛水溶性總蛋白保護胃黏膜損傷的作用卻未見報道。

阿司匹林作為非甾體抗炎藥（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）的代表，近年來廣泛應(yīng)用于治療各種風濕性疾病及心腦血管疾病的預(yù)防，是全球最暢銷的藥品之一。其所致的胃黏膜損傷、潰瘍及出血等急性胃黏膜病變（acute gastric mucosal lesion，AGmL）目前已引起人們的重視，其主要病理特征為急性應(yīng)激性病變，使機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，是臨床上常見的急性胃黏膜病變之一[6]。目前已報道臨床上可用于保護胃黏膜的藥物有質(zhì)子泵抑制劑、鋁／鉍制劑、H2受體拮抗劑、胃泌素受體等，但往往存在療效不持久、停藥后容易復(fù)發(fā)、副作用多、價格昂貴等諸多缺點，這些缺點使得NSAIDs的臨床應(yīng)用受到了極大限制[7-11]。因此，積極研究并開發(fā)純天然的中藥成分抑制阿司匹林所致的胃黏膜損傷對NSAIDs的臨床應(yīng)用有極大意義。

本文在課題組前期研究基礎(chǔ)上，采用鐵皮石斛水溶性總蛋白對阿司匹林誘導(dǎo)的大鼠急性胃黏膜損傷進行預(yù)保護，通過測定大鼠血清中前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-1β（（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，胃組織中環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA 的表達量以COX-2、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，Erk1/2）蛋白的表達量，證實鐵皮石斛水溶性總蛋白保護大鼠急性胃黏膜損傷及炎癥反應(yīng)的機制可能與增強PGE2等胃黏膜保護因子，清除氧自由基，降低炎癥反應(yīng)介質(zhì)并激活Erk1/2通路使胃黏膜細胞增殖有關(guān)，為日后進一步開發(fā)鐵皮石斛產(chǎn)品提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 藥品及試劑

鐵皮石斛：婷美小屋；鐵皮石斛水溶性總蛋白：長春中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥大健康創(chuàng)新中心提供；阿司匹林（純度＞99.0%）：Sigma公司；奧美拉唑（純度＞98%）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）：索萊寶公司；大鼠血清 PGE2、IL-6、IL-1β、TNF-α、SOD、MDA酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒：上海朗頓生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液：碧云天生物技術(shù)公司；Trizol：Thermo Fisher Scientific；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、寶生物染料法熒光定量試劑盒（SYBR）：日本TaKaRa公司；β-Actin抗體、COX-2 抗體：美國 Bioworld 公司；Erk1/2、pErk1/2抗體：美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 主要儀器

全自動酶標儀（Infinite M200PR0）：瑞士帝肯公司；Mini Protean蛋白電泳儀（PowerPacTMHC）、實時熒光定量PCR儀（CFX connect）：美國伯樂公司；智能成像系統(tǒng)（iBright FL1000）：美國賽默飛世爾公司。

1.3 動物

SPF級Wistar大鼠：長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司。

2 方法

2.1 大鼠分組、給藥以及急性胃損傷模型的建立

選取 6周齡 Wistar大鼠（200 g～250 g）50只，雌雄各半，隨機分為空白對照組、模型組，鐵皮石斛水溶性總蛋白低劑量組、高劑量組，陽性對照組。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，空白對照組與模型組灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉；低劑量組、高劑量組分別給予10、20 mg/kg，陽性對照組給予奧美拉唑3 mg/kg，連續(xù)5 d。末次給藥后禁食不禁水，除空白對照組外均采用300 mg/kg阿司匹林灌胃5 h建立胃黏膜損傷模型。

2.2 胃黏膜損傷評價

大鼠腹腔注射適量10%水合氯醛，麻醉后固定在解剖板上，沿腹中線由下而上剪開腹腔，摘除胃，用生理鹽水清洗，沿胃大彎剪開，用冰生理鹽水輕輕沖洗胃黏膜表面的污物，用濾紙吸干、除凈胃黏膜表面的黏液、血凝塊等，用4%多聚甲醛固定，拍照后用Image J軟件分析胃黏膜損傷程度[12]。

2.3 ELISA 檢測血清中 PGE2、IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD、MDA的含量

大鼠腹腔注射適量10%水合氯醛，麻醉后固定在解剖板上，沿腹中線由下而上剪開腹腔，腹主動脈采血5 mL，4℃條件下3 000 r/min離心10 min，取上層血清。按照ELISA KIT說明書中操作方法測定血清中PGE2、IL-1β、IL-6、TNF-α 含量[13]。

2.4 RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）

取適量胃組織，放入用放入用焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理并經(jīng)過高溫高壓滅菌過的水浸泡過夜的預(yù)冷研缽中，加入液氮小心研磨至無肉眼可見組織塊，加入1 mL Trizol提取RNA，測定濃度后，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA稀釋適當倍數(shù)后，取2.5 μL，加入到含 SYBR Premix Ex Taq TMⅡ（2×）12.5 μL、雙蒸水8 μL、上下游引物各1μL的體系中。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 30 s、95 ℃變性 5 s、退火 30 s、72 ℃延伸 20 s，40個循環(huán)[14]。反應(yīng)后繪制擴增曲線，對目的基因擴增后產(chǎn)物的表達量與β-Actin擴增后表達量的比值進行結(jié)果分析。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

續(xù)表1 引物序列Continue table 1 Primer sequences

2.5 蛋白提取和Western blot

適量胃組織，放入預(yù)冷研缽中，加入液氮小心研磨至無肉眼可見組織塊，加入1 mL RIPA裂解液裂解液及10 μL PMSF，用移液器吹打數(shù)次后轉(zhuǎn)移至離心管中，冰上裂解20 min，4℃條件下12 000 r/min離心10 min，取上清，使用BCA試劑盒測定蛋白含量，制樣。配置聚丙烯酰氨凝膠電泳所需的凝膠，上樣，70 V 30 min，140 V 50 min電泳后使用NC膜18 V 350 mA半濕法轉(zhuǎn)膜20 min，5%磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）配置的 奶粉封閉30 min，磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate tween buffer，PBST）洗滌膜片3 次，每次5 min，切膜，4℃一抗孵育過夜（β-Actin、Erk1/2、pErk1/2均按1∶1 000稀釋；COX-2按 1∶500稀釋），收集一抗，用1%PBS奶粉稀釋二抗，二抗孵育1 h，顯色處理，避光。結(jié)果用Image J軟件進行灰度值分析。

2.6 統(tǒng)計學分析

3 結(jié)果

3.1 胃損傷程度

大鼠胃黏膜損傷情況見圖1。以胃黏膜損傷面積占整個胃黏膜面積的百分比來評價胃的損傷程度，結(jié)果見表2。

圖1 大鼠胃黏膜損傷情況Fig.1 Rat gastric mucosal injury

表2 各組大鼠給藥劑量及胃損傷程度（±s，n=10）Table 2 The dose of rats and the degree of gastric damage in each group（±s，n=10）

表2 各組大鼠給藥劑量及胃損傷程度（±s，n=10）Table 2 The dose of rats and the degree of gastric damage in each group（±s，n=10）

注：與對照組相比##p<0.01表示差異極顯著；與模型組相比**p<0.01表示差異極顯著；-表示未給藥。

處理劑量/（mg/kg）胃損傷程度/%空白對照組 - 3.04±0.692模型組 - 56.34±2.71##鐵皮石斛水溶性總蛋白 10 38.88±0.59**20 15.87±0.84**奧美拉唑 3 26.39±1.02**

空白對照組胃損傷面積為（3.04±0.692）%，結(jié)果與模型組相比有極顯著差異（p<0.01）。模型組、低劑量組、高劑量組及奧美拉唑組經(jīng)阿司匹林灌胃5 h損傷后的損傷面積分別為（56.34±2.71）%、（8.88±0.59）%、（15.87±0.84）%以及（26.39±1.02）%。各給藥組與模型組相比均有極顯著性差異，且鐵皮石斛水溶性總蛋白高劑量組恢復(fù)效果最好。表明隨著鐵皮石斛水溶性總白濃度的增大胃損傷程度逐漸下降，鐵皮石斛對胃損傷具有一定的預(yù)防作用。

3.2 鐵皮石斛水溶性總蛋白對大鼠血清中PGE2水平的影響

大鼠血清中PGE2水平如表3所示。

表3 大鼠血清中PGE2水平（±s，n=10）Table 3 PGE2 levels in rat serum（±s，n=10）

表3 大鼠血清中PGE2水平（±s，n=10）Table 3 PGE2 levels in rat serum（±s，n=10）

注：與對照組相比##p<0.01表示差異極顯著；與模型組相比**p<0.01表示差異極顯著。

組別PGE2/（ng/L）空白對照組 654.4±30.18模型組 331.46±10.74##低劑量組 424.8±49.8高劑量組 569.64±44.77**奧美拉唑組 480.02±21.89**

與對照組相比，模型組大鼠血清中PGE2水平明顯下降（p<0.01），鐵皮石斛水溶性總蛋白預(yù)保護使大鼠血清中PGE2水平逐漸回升，且高劑量組效果最好（p<0.01），表明鐵皮石斛水溶性總蛋白可以通過升高PGE2含量達到保護阿司匹林誘導(dǎo)的胃黏膜損傷的效果。

3.3 鐵皮石斛水溶性總蛋白對大鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響

大鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平如表4所示。

表4 大鼠血清中炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平（±s，n=10）Table 4 Levels of inflammatory factors IL-1β，IL-6 and TNF-α in rat serum（±s，n=10）

表4 大鼠血清中炎癥因子 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平（±s，n=10）Table 4 Levels of inflammatory factors IL-1β，IL-6 and TNF-α in rat serum（±s，n=10）

注：與對照組相比##p<0.01表示差異極顯著，#p<0.05表示差異顯著；與模型組相比*p<0.05表示差異顯著，**p<0.01表示差異極顯著。

組別IL-6/（ng/L）IL-1β/（ng/L）TNF-α/（ng/L）空白對照組 177.08±0.6 29.13±3.68 156.47±7.32模型組 343.98±12.14##57.35±4.01##341.49±36.07#鐵皮石斛水溶性總蛋白低劑量組229.90±30.86**43.07±2.01*209.12±4.51**鐵皮石斛水溶性總蛋白高劑量組128.45±8.17**34.10±3.07**169.39±14.24*奧美拉唑組 172.67±2.90**39.45±3.97*207.19±16.39

與對照組相比，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 的水平均有所升高（p<0.01；p<0.01；p<0.05），表明阿司匹林誘導(dǎo)大鼠胃黏膜產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。與模型組相比，鐵皮石斛水溶性總蛋白預(yù)保護使大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平明顯降低，結(jié)果呈濃度依賴性，且高劑量組預(yù)保護后大鼠血清中IL-6水平高于對照組，表明鐵皮石斛水溶性總蛋白對阿司匹林造成的炎癥損傷有較好的保護作用。

3.4 鐵皮石斛水溶性總蛋白對大鼠血清中氧化應(yīng)激指標SOD、MDA水平的影響

大鼠血清中氧化應(yīng)激指標SOD、MDA水平如表5所示。

表5 大鼠血清中氧化應(yīng)激指標SOD、MDA水平（±s，n=10）Table 5 Oxidative stress indicators SOD，MDA levels in rat serum（±s，n=10）

表5 大鼠血清中氧化應(yīng)激指標SOD、MDA水平（±s，n=10）Table 5 Oxidative stress indicators SOD，MDA levels in rat serum（±s，n=10）

注：與對照組相比##p<0.01表示差異極顯著，#p<0.05表示差異顯著；與模型組相比*p<0.05表示差異顯著，**p<0.01表示差異極顯著。

組別SOD/（ng/mL）MDA/（nmol/mL）空白對照組 7.55±1.34 20.12±2.77模型組 4.05±0.48#39.78±1.38##鐵皮石斛水溶性總蛋白低劑量組 4.61±1.88 19.49±0.83**鐵皮石斛水溶性總蛋白高劑量組 6.18±0.18**14.41±2.7**奧美拉唑組 6.12±0.8**17.71±3.58*

與對照組相比，模型組大鼠SOD含量有所下降（p<0.05）、MDA含量明顯升高（p<0.01），表明阿司匹林引起了胃黏膜的氧化損傷。與模型組相比，鐵皮石斛水溶性總蛋白預(yù)保護使SOD含量逐漸上升、MDA含量明顯下降，且高劑量組效果最明顯，結(jié)果均具有極顯著差異，表明鐵皮石斛水溶性總蛋白對阿司匹林誘導(dǎo)的胃黏膜氧化損傷有一定的保護作用。

3.5 鐵皮石斛水溶性總蛋白對大鼠胃組織中COX-2、IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA 表達的影響

大鼠胃組織中 COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達如圖2所示。

圖2 大鼠胃組織中COX-2、IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達Fig.2 mRNA expression of COX-2，IL-1β，IL-6 and TNF-α in rat gastric tissue

與對照組相比，模型組大鼠胃組織COX-2、IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA表達明顯上調(diào)，且均具有極顯著差異（p＜0.01）；鐵皮石斛水溶性總蛋白預(yù)處理后可使胃組織中 COX-2、IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA 表達下調(diào)，且隨著藥物濃度升高作用效果更明顯。表明鐵皮石斛水溶性總蛋白能對阿司匹林誘導(dǎo)的大鼠胃黏膜損傷及炎癥反應(yīng)起到一定程度的保護作用。

3.6 鐵皮石斛水溶性總蛋白對大鼠胃組織中COX-2蛋白表達的影響

COX-2蛋白表達如圖3所示。

圖3 大鼠胃組織COX-2蛋白表達Fig.3 COX-2 protein expression in rat stomach tissue

與對照組相比，模型組大鼠胃組織COX-2蛋白明顯上調(diào)（p＜0.01），鐵皮石斛水溶性總蛋白預(yù)處理后，COX-2蛋白有明顯下調(diào)，且結(jié)果均具有極顯著差異（p＜0.01，p＜0.01），表明鐵皮石斛水溶性總蛋白通過下調(diào)COX-2蛋白表達量起到保護胃黏膜損傷的作用。

3.7 鐵皮石斛水溶性總蛋白對大鼠胃組織中Erk1/2、pErk1/2蛋白表達的影響

Erk1/2、pErk1/2蛋白表達如圖4所示。

與對照組相比，模型組大鼠胃組織中Erk1/2/pErk1/2的比值明顯上調(diào)（p＜0.01），表明發(fā)生胃黏膜損傷時Erk1/2通路被激活，從而起到保護胃黏膜損傷的作用。經(jīng)鐵皮石斛水溶性總蛋白預(yù)處理后，Erk1/2/pErk1/2有明顯下調(diào)，且結(jié)果均具有極顯著差異（p＜0.01），表明鐵皮石斛水溶性總蛋白通過激活Erk1/2通路起到保護胃黏膜損傷的作用。

4 討論

圖4 大鼠胃組織中Erk1/2、pErk1/2蛋白表達Fig.4 Erk1/2，pErk1/2 protein expression in rat gastric tissue

歷代中醫(yī)古籍中多有石斛“厚腸胃”相關(guān)功效的報道，作為臨床常用的“胃腸藥”，其“益胃”功效得到廣泛認可。國內(nèi)早期研究報道，鐵皮石斛對胃黏膜損傷有較好的保護作用[15-17]，但目前多數(shù)研究集中于鐵皮石斛多糖對胃黏膜損傷的保護作用[18]，對鐵皮石斛水溶性總蛋白的相關(guān)研究未見報道。本文通過阿司匹林誘導(dǎo)大鼠急性胃黏膜損傷模型，對鐵皮石斛水溶性總蛋白保護大鼠急性胃損傷及炎癥反應(yīng)的機制進行初步研究。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)胃黏膜具有由防御因子組成的“胃黏膜防御屏障”體系：黏液－碳酸氫鹽屏障、黏膜屏障、表皮生長因子、前列腺素等，它們相互協(xié)調(diào)，共同對抗攻擊因子對胃黏膜的損傷。目前對NSAIDs造成的胃黏膜損傷機制尚未完全闡明，但其發(fā)生、發(fā)展必定是一個復(fù)雜的、多因素綜合的過程，與氧自由基、炎癥因子等攻擊因子增強以及前列腺素等保護因子的減弱外有關(guān)[19-22]。

PGE2是人體中的一種重要細胞生長因子，可增加胃黏液的分泌量及胃黏膜血流量，繼而增強胃黏膜抗損傷能力。COX-2是體內(nèi)重要的炎癥調(diào)節(jié)因子，參與介導(dǎo)前列腺素的產(chǎn)生，是PGE2合成的限速酶，在正常的多數(shù)體內(nèi)細胞中并不表達，或者僅僅是少量表達于胃壁相關(guān)細胞或內(nèi)皮細胞中，與IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子在胃損傷導(dǎo)致炎癥反應(yīng)中起協(xié)同作用。除炎癥反應(yīng)外，氧化應(yīng)激也是胃潰瘍發(fā)生的重要基質(zhì)，胃黏膜損傷時可能引起機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致血清中SOD含量減少，MDA含量增加，機體內(nèi)氧化與抗氧化之間的平衡被破壞，造成中性粒細胞炎性浸潤，最終導(dǎo)致組織、細胞氧化損傷的病理過程[23]。Erk1/2作為MAPK中的一員，對調(diào)控應(yīng)激炎癥反應(yīng)具有重要作用，可被一系列細胞外的刺激信號激活并介導(dǎo)信號從細胞膜向細胞核傳導(dǎo)，參與胃黏膜上皮增殖、分化等過程的調(diào)節(jié)，諸多報道證實激活Erk1/2通路對大鼠胃損傷愈合過程具有重要意義[24-26]。Erk1/2通路的激活不僅可促進胃黏膜細胞的增殖，而且還可以與PGE2共同作用，增加胃黏膜血流量，促進胃黏膜損傷的修復(fù)。

本實驗通過采用阿司匹林灌胃5 h的造模方法建立了大鼠急性胃黏膜損傷模型，通過ELISA、RT-PCR等方法對大鼠血清及胃組織中的炎癥因子進行檢測，發(fā)現(xiàn)模型組炎癥因子水平有明顯上調(diào)，證明阿司匹林造成的胃黏膜損傷伴有嚴重的炎癥反應(yīng)，同時對SOD及MDA含量進行檢測，發(fā)現(xiàn)模型組SOD含量減少，MDA含量增加，表明此時機體發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)；經(jīng)鐵皮石斛水溶性總蛋白預(yù)處理后，上述反應(yīng)有明顯好轉(zhuǎn)，炎癥因子水平隨著給藥劑量明顯下調(diào)，SOD含量有所上調(diào)，MDA含量有所下調(diào)，表明機體炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)有明顯減少，證實了鐵皮石斛水溶性總蛋白對胃黏膜的預(yù)保護作用。為了進一步探討其作用機制，采用WB法對COX-2以及Erk1/2、pErk1/2 3個因子的水平進行了檢測，發(fā)現(xiàn)模型組有明顯上調(diào)，給藥組隨著劑量逐漸下調(diào)，表明COX-2/Erk1/2通路被激活，可能通過促進胃黏膜細胞增殖等作用達到保護胃黏膜的作用。綜上所述，鐵皮石斛水溶性總蛋白對胃黏膜損傷的保護機制可能與增強PGE2等胃黏膜保護因子，增加胃黏膜血流量，清除氧自由基，降低炎癥反應(yīng)介質(zhì)的含量以及激活Erk1/2通路使胃黏膜細胞增殖有關(guān)，但更深入的機制研究還需要進一步探討。