蔣 靚，張光波，謝金晶，李維潔，湯龍海

（1.蘇州市中心血站，江蘇 蘇州 215006；2. 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院江蘇省臨床免疫研究所，江蘇 蘇州 215007）

血小板是哺乳動物血液中的有形成分之一，直徑只有2～3 μm，是血液中最小的血細(xì)胞，其主要是骨髓成熟的巨核細(xì)胞質(zhì)裂解形成的不規(guī)則碎片。血小板在體內(nèi)發(fā)揮著重要作用，如止血凝血、炎癥反應(yīng)以及免疫應(yīng)答等[1]。因此血小板輸注在臨床治療中具有重要地位，機(jī)采血小板能夠穩(wěn)定血小板質(zhì)量，提高采集效率以及增加安全性，但在(22±2)℃震蕩保存的機(jī)采血小板保存期為5 d，隨著保存時(shí)間以及暴露時(shí)間的增加，機(jī)采血小板的聚集水平以及活性損傷發(fā)生變化。相關(guān)研究表明，血清總膽固醇（TC）水平升高易導(dǎo)致動脈粥樣硬化及相關(guān)疾病的發(fā)生[2]。本次研究旨在探討體外膽固醇負(fù)載對機(jī)采血小板在保存期間的活化損傷影響，現(xiàn)將相關(guān)情況總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 擬納入2019年4月—2019年6月蘇州市中心血站無償捐獻(xiàn)機(jī)采血小板供者35 名，男性，年齡為25～40 歲。符合國家規(guī)定的獻(xiàn)血者體檢標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)滿足以下要求：采前外周靜脈血血小板達(dá)到(150～449)×109/L；2 次的采集間隔時(shí)間≥14 d；采集前72 h內(nèi)未服用阿司匹林類藥物。使用自動生化分析儀進(jìn)行臨床常規(guī)TC測定，根據(jù)血小板捐獻(xiàn)者的血清TC水平分為兩組：血清總膽固醇水平升高組（TC≥5.2 mmoL/L，n＝31）和血清總膽固醇水平正常組（TC＜5.2 mmoL/L，n＝4）。

1.2 方法 采用濾白法機(jī)采血小板，采用MCS+血細(xì)胞分離機(jī)和994E耗材（美國血液技術(shù)公司），選擇LDPLP程序進(jìn)行血小板采集。血小板采集設(shè)定量為≥2.5×1011/袋；血小板容量設(shè)定為250～300 mL；同時(shí)進(jìn)行血小板質(zhì)控檢測，質(zhì)量符合機(jī)采血小板國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。利用機(jī)采血小板的留樣袋，每人份留取血小板10 mL，置于(22±2)℃水平震蕩的血小板保存箱內(nèi)保存，分別于第2、3、4、5天時(shí)，取出部分血小板使用小留樣袋或EP管分裝4 袋，室溫下靜置，分別于0、30、60、120 min留取血小板樣本，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。流式細(xì)胞儀檢測：用磷酸鹽緩沖液調(diào)整血小板濃度為(1～3)×109/L的血小板懸液。同型對照組加入磷酸鹽緩沖液各20 μL；測定管加CD63-FITC、CD36-PE、CD40-FITC、CD62p-PE各20 μL；取上述血小板懸液20 μL分別加入同型對照管和測定管，輕輕混勻，室溫下避光孵育15 min；加入1 mL 4%多聚甲醛混勻，上機(jī)檢測。

1.3 觀察指標(biāo) 分別于保存第2、3、4、5天進(jìn)行兩組血小板計(jì)數(shù)，并于0、30、60、120 min使用流式細(xì)胞儀檢測血小板的CD63、CD36、CD40以及CD62p表達(dá)水平。觀察比較兩組不同血清TC水平下的血小板活化水平，其中包括CD63：血小板顆粒膜蛋白，為血小板的活化指標(biāo)；CD36：血小板膜糖蛋白是磷脂酰絲氨酸的主要受體，廣泛存在于血小板、脂肪粒細(xì)胞中，與血小板活化指標(biāo)密切相關(guān)；CD40：與血小板活化呈正相關(guān)，是炎癥相關(guān)因子，可以作為血小板活化的表面標(biāo)志物；CD62p（P選擇素）：血小板溶酶體膜糖蛋白，是血小板活化的表面標(biāo)志物，能夠準(zhǔn)確反映血小板的活化程度[3]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)使用Excel軟件和SPSS 11.0進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)，血小板的檢測數(shù)據(jù)使用中位數(shù)表示；兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Wilcoxon檢驗(yàn)，兩組以上數(shù)據(jù)之間比較采用Friedman檢驗(yàn)，若P＜0.05，表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

血清總膽固醇升高組血小板在不同保存時(shí)間下的CD63、CD36、CD40以及CD62p的表達(dá)率同血清總膽固醇正常組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 兩組血小板活性的比較

血清總膽固醇升高組血小板在不同暴露時(shí)間下的CD63、CD36、CD40以及CD62p的表達(dá)率與血清總膽固醇正常組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2～表5）

表2 兩組血小板第2天活性的比較

表3 兩組血小板第3天活性的比較

表4 兩組血小板第4天活性的比較

表5 兩組血小板第5天活性的比較

3 討論

受到現(xiàn)有技術(shù)制約以及血小板具有特殊的分子結(jié)構(gòu)，新鮮血液中分離出的血小板在22 ℃、60 次/min振蕩條件下的存放時(shí)間僅為5 d，這種較短的保存時(shí)間極大地限制了臨床上急需輸血患者的急救。由于血小板在保存過程中因活化而黏附能力上升，國內(nèi)外輸血界一直關(guān)注血小板制備與保存的相關(guān)問題，亟待尋找導(dǎo)致血小板活化的相關(guān)負(fù)性調(diào)控因子[4]?；罨“宓谋砻鏄?biāo)志物可以通過流式細(xì)胞儀檢測到，不同于CD63在血小板的質(zhì)膜中表達(dá)，CD62P是血小板活化過程中釋放最多的顆粒膜上糖蛋白，在血小板的活化過程中其上升最為明顯，較為容易檢測到，一般作為血小板保存過程中最主要的質(zhì)控指標(biāo)之一。另外，CD36以及CD40/CD40L在血小板正常情況下基本不表達(dá)，只有血小板功能受損，質(zhì)膜發(fā)生結(jié)構(gòu)變化暴露出其糖表位才能夠檢測到其表達(dá)升高[5]。本次研究中設(shè)置不同暴露時(shí)間下，血小板活化能力的變化表明，在5 d保存期間內(nèi)，血小板的活化水平?jīng)]有顯著上升，表明機(jī)采血小板在22 ℃、60 次/min振蕩條件下能夠一定程度上保留血小板的活性以及功能，維持其黏附結(jié)合能力，減少血源性疾病的傳播，對于臨床病人急救輸注具有不可代替的作用。動脈粥樣硬化以及與其相關(guān)的血栓等疾病的發(fā)生，例如中風(fēng)、心肌梗死等疾病密切相關(guān)的是體內(nèi)膽固醇水平升高[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，患有高脂血癥的病人體內(nèi)血小板的活化損傷水平、血小板炎癥反應(yīng)以及聚集水平明顯增強(qiáng)，并且相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)也表明，膽固醇水平過高容易導(dǎo)致血小板活化能力增強(qiáng)[8-10]。本次研究旨在表明，體外膽固醇負(fù)載對機(jī)采血小板在保存期間的活化損傷無顯著影響。

本次研究表明，機(jī)采血小板的活性損傷與高TC水平無顯著相關(guān)性，高TC水平的獻(xiàn)血者提供的血小板在保存期間以及相關(guān)暴露時(shí)間下無明顯活化聚集影響，可用于患者的臨床輸注。綜上所述，在血小板保存期內(nèi)，血小板在不同暴露時(shí)間下其活性變化無明顯差異，不同TC水平的獻(xiàn)血中，TC水平對血小板的活化水平無顯著影響，在使用機(jī)采血小板進(jìn)行輸注時(shí)可以選擇高水平TC的獻(xiàn)血者提供的血小板，進(jìn)而提高血小板采集范圍和來源。