周亞娜 周廣文 張麟 張妍 譚張奎 李章青 黃詩(shī)怡 熊夢(mèng)欣 向楠

[摘要] 目的 觀察補(bǔ)腎化痰方對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松（PMOP）模型大鼠骨重建平衡的影響。 方法 選取6月齡SD雌性大鼠30只，按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分為假手術(shù)組、模型組及中藥組，每組10只。假手術(shù)組及中藥組均以卵巢切除術(shù)造模，假手術(shù)組僅切除卵巢旁等量脂肪。術(shù)后5周開(kāi)始灌胃，中藥組給予補(bǔ)腎化痰方，假手術(shù)組和模型組灌服等量生理鹽水。12周末大鼠處死后取材，分別采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、蛋白質(zhì)印跡法及免疫組化法檢測(cè)血清及骨組織骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）、骨保護(hù)素（OPG）、核因子κB受體活化因子配體（RANKL）的含量及定位，采用micro CT檢測(cè)大鼠的骨密度，比較分析各組間各個(gè)指標(biāo)的差異。 結(jié)果 模型組和中藥組大鼠骨密度及血清BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL含量均低于假手術(shù)組，RANKL含量高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。中藥組大鼠骨密度及血清BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL含量均高于模型組，RANKL含量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。模型組和中藥組大鼠骨組織BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL灰度值均低于假手術(shù)組，RANKL灰度值高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。中藥組大鼠骨組織BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL灰度值均高于模型組，RANKL灰度值低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，BMP2、RUNX2、OPG的陽(yáng)性表達(dá)主要位于骨髓基質(zhì)細(xì)胞胞漿及骨小梁周邊成骨細(xì)胞中;RANKL的陽(yáng)性表達(dá)位于骨質(zhì)邊緣破骨細(xì)胞中，呈棕黃色顆粒。 結(jié)論 補(bǔ)腎化痰方能夠通過(guò)BMP2/Smad/RUNX2信號(hào)通路及OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路調(diào)控骨重建平衡，從而起到治療PMOP的作用。

[關(guān)鍵詞] 補(bǔ)腎化痰方;骨組織骨形態(tài)發(fā)生蛋白2/Smad/Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2;骨保護(hù)素/核因子κB受體活化因子配體/核因子κB受體活化因子;絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松

[中圖分類號(hào)] R-332 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2020）04（b）-0008-05

Effect of Bushen Huatan Decoction on bone remodeling balance in ovariectomized osteoporosis rats

ZHOU Ya′na1* ? ZHOU Guangwen2* ? ZHANG Lin3 ? ZHANG Yan4 ? TAN Zhangkui4 ? LI Zhangqing4 ? HUANG Shiyi4 ? XIONG Mengxin4 ? XIANG Nan4

1.Department of Oncology， Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hubei Province， Wuhan ? 430061， China; 2.College of Acupuncture and Bone Injury， Hubei University of Chinese Medicine， Hubei Province， Wuhan ? 430065， China; 3.Department of Osteoarticular Surgery， Wuhan Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine ?Wuhan NO.1 Hospital， Hubei Province， Wuhan ? 430061， China; 4.the First Clinical College， Hubei University of Chinese Medicine， Hubei Province， Wuhan ? 430065， China

[Abstract] Objective To study the effect of Bushen Huatan Decoction on bone remodeling balance in ovariectomized osteoporosis rats. Methods Thirty-six month old female SD rats were divided into three groups： sham operation group， model group and traditional Chinese medicine group according to the random number table method， with 10 rats in each group. In sham operation group and traditional Chinese medicine group， the model was made by ovariectomy. In sham operation group， only the same amount of fat was removed. 5 weeks after operation， rats in traditional Chinese medicine group were given Bushen Huatan Decoction， and rats in sham operation group and model group were given the same amount of normal saline. 12 weeks after rats were killed， the content and localization of bone morphogenetic protein 2 （BMP2）， runt related transcription factor 2 （RUNX2）， osteoprotegerin （OPG）， nuclear factor kappa B receptor activating factor ligand （RANKL） in serum and bone tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent assay， Western blot and immunohistochemistry respectively. Bone mineral density of rats was measured by micro CT， and the differences of each index between each group were analyzed. Results Bone mineral density and serum BMP2， RUNX2， OPG and OPG/RANKL contents of model group and traditional Chinese medicine group were lower than those of sham operation group， and RANKL content was higher than that of sham operation group， with statistically significant differences （P < 0.05）. Bone mineral density and serum BMP2， RUNX2， OPG， OPG/RANKL content of the rats in traditional Chinese medicine group were higher than those in model group， and RANKL content was lower than that in model group， with statistically significant difference （P < 0.05）. BMP2， RUNX2， OPG and OPG/RANKL gray values of bone tissue in model group and traditional Chinese medicine group were lower than those in sham operation group， and the RANKL gray values were higher than those in sham operation group （P < 0.05）. BMP2， RUNX2， OPG and OPG/RANKL gray values of bone tissue in traditional Chinese medicine group were higher than those in model group， and RANKL gray values were lower than those in model group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The results of immunohistochemistry showed that the positive expression of BMP2， RUNX2 and OPG was mainly located in the cytoplasm of bone marrow stromal cells and osteoblasts around the trabecula; the positive expression of RANKL was located in osteoclasts at the border of bone， which were brownish yellow granules. Conclusion Bushen Huatan Decoction can regulate bone remodeling balance through BMP2/Smad/RUNX2 signal pathway and OPG/RANKL/RANK signal pathway to treat postmenopausal osteoporosis.

[Key words] Bushen Huatan Decoction; BMP2/Smad/RUNX2; OPG/RANKL/RANK; Postmenopausal osteoporosis

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松（PMOP）是全身代謝性骨病，以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加、易發(fā)骨折為特征，致殘率和致死率高，嚴(yán)重威脅中老年婦女的健康[1]?，F(xiàn)代研究表明，PMOP的發(fā)生與骨形成[成骨細(xì)胞（OB）介導(dǎo)]和骨吸收[破骨細(xì)胞（OC）介導(dǎo)]之間動(dòng)態(tài)失衡密切相關(guān)。調(diào)控骨組織骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）/Smad/Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）信號(hào)通路會(huì)影響OB的分化及骨細(xì)胞外基質(zhì)合成與分泌，能夠促進(jìn)骨的形成及增加骨的含量[2];而在骨吸收和骨形成的偶聯(lián)中，骨保護(hù)素（OPG）/核因子κB受體活化因子配體（RANKL）/核因子κB受體活化因子（RANK）信號(hào)通路起關(guān)鍵作用[3]。中醫(yī)藥防治PMOP是我國(guó)獨(dú)具特色和優(yōu)勢(shì)的治療方式，在改善患者臨床癥狀方面療效顯著[4]。湖北名師向楠教授基于痰濁在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病中的作用，結(jié)合《本草綱目》補(bǔ)骨脂丸與《丹溪心法》黃瓜蔞丸加減而成補(bǔ)腎化痰方[5-6]。在臨床中，向楠教授以此方為基礎(chǔ)方，辨證論治PMOP，取得了良好的臨床效果，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了一系列研究[7-9]。本研究旨在探討補(bǔ)腎化痰方對(duì)PMOP大鼠骨重建平衡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，6月齡，雌性，體重250～350 g，共30只，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2015-0018，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：42000600017470。飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度18～25℃，濕度45%～55%，保證飼料飲水充足。實(shí)驗(yàn)由湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)審查通過(guò)。

1.2 藥物與試劑

補(bǔ)腎化痰方由淫羊藿、補(bǔ)骨脂、菟絲子、全瓜蔞、紅曲、山楂構(gòu)成（含量分別為10、15、30、15、12、20 g）;湖北省中醫(yī)院門診部藥房提供研究用生藥，并由實(shí)驗(yàn)研究人員加水煎煮濃縮，于4℃冰箱貯存?zhèn)溆?。試劑：大鼠OPG試劑盒（貨號(hào)：JYM0510Ra）、RANKL試劑盒（貨號(hào)：JYM0391Ra）、BMP2試劑盒（貨號(hào)：JYM0665Ra）、RUNX2試劑盒（貨號(hào)：JYM0899Ra）均由武漢基因美生物科技有限公司提供;OPG抗體（貨號(hào)：Ab73400）、BMP2抗體（貨號(hào)：Ab14933）、大鼠RUNX2抗體（貨號(hào)：Ab23981m）均購(gòu)自Abcam;RANKL抗體（貨號(hào)：Sc-7628，Snata）。

1.3 儀器與設(shè)備

uCT50（SCANCO MEDICAL，瑞士）;MK3酶標(biāo)儀（Lab systems Multi-skan MS公司，芬蘭）;Tanon-5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能公司）;RM2235石蠟切片機(jī)（徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥

適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠，1周后腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，無(wú)菌條件下俯臥固定，背側(cè)正中切口后按照隨機(jī)數(shù)字表法分組處理。假手術(shù)組僅切除卵巢周圍與雙側(cè)卵巢重量等同的脂肪組織，而不摘除卵巢;模型組與中藥組均行卵巢切除術(shù)建立PMOP大鼠模型，在腎下極附近尋找到卵巢后用4號(hào)線結(jié)扎并雙側(cè)摘除，分層縫合切口。造模術(shù)后5周，開(kāi)始給藥;假手術(shù)組和模型組均灌胃1 mL/100 g的生理鹽水，中藥組以0.94 g/mL灌胃補(bǔ)腎化痰方，1次/d，持續(xù)8周。

1.5 血清BMP2、RUNX2、OPG、RANKL檢測(cè)

12周末，大鼠眼球取血，肝素抗凝，30 min內(nèi)3000 r/min（離心半徑為8 cm）離心，取上清，保存于 -20℃冰箱備用。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）參照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)血清BMP2、RUNX2、OPG、RANKL含量。

1.6 骨組織BMP2、RUNX2、OPG、RANKL蛋白檢測(cè)

12周末，大鼠處死后，取右側(cè)股骨洗凈。取部分骨片研磨、提取蛋白，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)骨組織BMP2、RUNX2、OPG、RANKL蛋白的表達(dá)，其余部分放入4%多聚甲醛固定液中固定、脫鈣，免疫組化檢測(cè)BMP2、RUNX2、OPG、RANKL定位。

1.7 骨密度及骨微結(jié)構(gòu)檢測(cè)

取大鼠左側(cè)的股骨放在micro CT載物臺(tái)上固定。以360°掃描角度、15 μm的掃描分辨率，沿大鼠股骨長(zhǎng)軸方向，對(duì)股骨近干骺段，進(jìn)行X線掃描，以獲取到連續(xù)、平面的μ-CT圖像。掃描完成后，選取生長(zhǎng)板遠(yuǎn)端骨組織作為松質(zhì)骨感興趣區(qū)域，將最低閾值設(shè)為170，來(lái)進(jìn)行股骨的三維重組，并提取圖像信息，最后用自帶軟件進(jìn)行定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般觀察

大鼠于麻醉后3～4 h全部蘇醒，進(jìn)食正常，活動(dòng)正常，切口均無(wú)紅腫、感染征象。1周后，切口愈合。灌胃時(shí)模型組和中藥組分別有1只和2只大鼠死亡。

2.2 各組大鼠骨密度及血清相關(guān)指標(biāo)比較

模型組和中藥組大鼠骨密度及血清BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL含量均低于假手術(shù)組，RANKL含量高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。中藥組大鼠骨密度及血清BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL含量均高于模型組，RANKL含量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 各組大鼠骨組織相關(guān)指標(biāo)比較

模型組和中藥組大鼠骨組織BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL灰度值均低于假手術(shù)組，RANKL灰度值高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。中藥組大鼠骨組織BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL灰度值均高于模型組，RANKL灰度值低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

免疫組化結(jié)果顯示，BMP2、RUNX2、OPG的陽(yáng)性表達(dá)主要位于骨髓基質(zhì)細(xì)胞胞漿及骨小梁周邊OB中（圖2～4，封四）;RANKL的陽(yáng)性表達(dá)位于骨質(zhì)邊緣OC中，呈棕黃色顆粒（圖5，封四）。

3 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)并無(wú)PMOP的病名，而根據(jù)對(duì)其證候群的描述，醫(yī)學(xué)界基本認(rèn)同感PMOP應(yīng)歸屬于“骨痿”“骨空”的范疇;而基于中醫(yī)基礎(chǔ)理論“腎主骨生髓”，目前臨床多“從腎論治”PMOP[10-11]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，PMOP的發(fā)病與脂代謝紊亂具有緊密的相關(guān)性[12]，而多項(xiàng)研究指出，“痰濁”的物質(zhì)基礎(chǔ)很可能是脂質(zhì)代謝紊亂[13]。基于此種認(rèn)識(shí)，向楠教授提出PMOP的治療應(yīng)從痰論[14]，并將補(bǔ)腎化痰方作為其臨床治療PMOP的基礎(chǔ)方。方中淫羊藿與補(bǔ)骨脂合用，同為君藥，發(fā)揮益腎壯陽(yáng)、強(qiáng)筋健骨的作用;菟絲子滋補(bǔ)肝腎、固精縮尿，全瓜蔞清熱化痰，兩藥相須同為臣藥;山楂善于消食化積、行氣散瘀，紅曲長(zhǎng)于健脾消食、活血化瘀，共為佐藥。諸藥相合，發(fā)揮補(bǔ)腎益髓、化痰調(diào)脂的作用。

骨骼是具有持續(xù)重塑周期特性，正常骨代謝包括骨形成和骨吸收，兩者是一對(duì)偶聯(lián)關(guān)系，其動(dòng)態(tài)的平衡對(duì)維持骨質(zhì)及骨量至關(guān)重要?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，多個(gè)參與骨代謝相關(guān)調(diào)控的信號(hào)通路，相互交叉，通過(guò)激活或抑制一些關(guān)鍵環(huán)節(jié)的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)OB或OC功能，進(jìn)而影響骨質(zhì)疏松的發(fā)病[15]。其中，BMP2/Smad/RUNX2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及OPG/RANKL/RANK信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)在維持骨重建平衡方面發(fā)揮重要作用。大量基礎(chǔ)試驗(yàn)研究證實(shí)，調(diào)控BMP2/Smad/RUNX2信號(hào)通路能夠促骨形成并增加骨量[2]。這與本研究發(fā)現(xiàn)基本一致，與假手術(shù)組比較，去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠血清及骨組織BMP2、RUNX2含量明顯降低，表明去勢(shì)大鼠的骨形成能力下降。淫羊藿的主要活性成分是淫羊藿苷，補(bǔ)骨脂素是補(bǔ)骨脂的主要有效成分，而研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷、補(bǔ)骨脂素配伍能夠通過(guò)調(diào)控BMP2及Smad1、4誘導(dǎo)BMSCs成骨分化，促進(jìn)骨形成[16]。因此，補(bǔ)腎化痰方中的補(bǔ)腎中藥可能通過(guò)提高大鼠血清及骨組織BMP2、RUNX2含量，調(diào)控BMP2/Smad/RUNX2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮促進(jìn)骨形成的作用。

在巨噬細(xì)胞集落刺激因子影響下，RANK與特異性結(jié)合配體RANKL并啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)OC的增殖、分化與成熟。而OB和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的OPG作為RANKL的假性受體，比膜受體RANK的結(jié)合能力強(qiáng)，可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合RANKL，阻止RANKL與RANK之間的相互作用，從而抑制OC的分化與活性，抑制骨重吸收過(guò)程[17]。本研究也顯示，與假手術(shù)組比較，PMOP大鼠血清及骨組織OPG含量均明顯下降，而RANKL含量明顯升高，且OPG/RANKL比值變化具有顯著差異，提示OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路的激活與骨質(zhì)疏松的發(fā)病密切有關(guān)。研究指出，淫羊藿苷、淫羊藿總黃酮可以不同程度降低RANKL的表達(dá)，提高OPG基因表達(dá)，從而發(fā)揮促骨形成作用[18];補(bǔ)骨脂提取物也可通過(guò)上調(diào)OPG、下調(diào)RANKL表達(dá)提高地塞米松誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨密度，改善其骨生物力學(xué)[19]。菟絲子黃酮也能夠調(diào)節(jié)去卵巢大鼠OPG、RANKL的水平，從而增加骨密度，改善骨質(zhì)疏松癥狀[20]。而紅曲能夠通過(guò)上調(diào)OPG mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)，抑制RANK表達(dá)，影響OPG/RANKL/RANK通路，抑制OC分化成熟，減緩PMOP的發(fā)病[21-22]?？梢?jiàn)，補(bǔ)腎化痰方可通過(guò)補(bǔ)腎、化痰多種中藥的綜合作用，提高骨組織OPG含量及OPG/RANKL比值，降低RANKL水平，發(fā)揮抑制骨吸收的作用。

綜上所述，補(bǔ)腎化痰方可以通過(guò)調(diào)控BMP2/Smad/RUNX2信號(hào)通路及OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路，在促進(jìn)骨形成的同時(shí)，抑制骨吸收，通過(guò)恢復(fù)骨重建的平衡，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松癥的作用。

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（收稿日期：2019-08-29 ?本文編輯：李亞聰）