李惠， 劉建林， 牛聰， 張威， 王慧超

（河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，河南開封 475000）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是終末期腎衰竭的主要原因[1]，占全世界需要透析治療的所有病例的35% ～40%。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全球有4.15 億成年人患有糖尿病，到2040 年將增加到6.42 億[2]。糖尿病發(fā)病率的上升使DN 成為當(dāng)前最重要的公共衛(wèi)生問題之一[3]，迫切需要開發(fā)新的療法來改善DN 治療。目前，許多植物藥被用作DN 的補充療法。中藥鳶尾科植物射干及鳶尾具有清熱解毒、利咽消痰、散血消腫的功效[4]，我國資源豐富。研究發(fā)現(xiàn)，射干和鳶尾的活性成分鳶尾黃素是一種天然異黃酮，結(jié)構(gòu)圖如圖1所示。已有研究表明，鳶尾黃素具有抗增殖，抗炎，抗氧化[5-7]，抑制醛糖還原酶、皮質(zhì)胰島素抵抗[7-8]，有降血糖、降血脂[9-10]等廣泛藥理學(xué)作用?；诖?，本研究旨在探討鳶尾黃素對大鼠DN 的治療作用，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

圖1 鳶尾黃素結(jié)構(gòu)式Figure 1 Chemical structure of tectorigenin

1 材料與方法

1.1 實驗動物48只5周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量（110±5）g，購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心，許可證號:SYXK（浙）2018-0012。于河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心飼養(yǎng)，溫控（22±1）℃，光控（200 lux，12 h 光暗循環(huán)），許可證號:SYXK（豫）2016-0006。

1. 2 主要藥物與試劑鳶尾黃素（化學(xué)式:C16H12O6；分子量:300.26；批號:67356），美國Sigma-Aldrich 公司生產(chǎn)。鹽酸二甲雙胍，購自中國食品藥品檢定研究院，批號:100664-201805。鏈脲佐菌素，購自美國Sigma-Aldrich 公司；蘇木素—伊紅染液，尿蛋白（UP）、血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、還原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）等測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）等酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒，cleaved caspase-3 抗體，核轉(zhuǎn)錄因子κB p65（NF-κB p65）抗體，磷酸化NF-κB p65（P-NF-κB p65）抗 體、GAPDH 抗 體 購 自 美 國Abcam公司。

1.3 主要儀器2404948 血糖儀（羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司）；AU5800 全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）；318C+酶標(biāo)儀（中國上海沛歐分析儀器有限公司）；723S 分光光度計（中國上海棱光技術(shù)有限公司）；DS360 全自動糖化血紅蛋白檢測分析儀（美國Drew Scientific公司）。

1.4 分組、動物模型建立與給藥將48只大鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d 后隨機(jī)分為4 組，即正常組、模型組、二甲雙胍組、鳶尾黃素組，每組12 只。造模[11]與給藥方法:除正常組，其他3組大鼠給予高糖高脂飼料（質(zhì)量分?jǐn)?shù)配方為20%蔗糖、12%豬油、5%奶粉、2%雞蛋和61%正常飼料）喂養(yǎng)3周后，一次性腹腔注射35 mg/kg 鏈脲佐菌素，構(gòu)建DN 大鼠模型。造模期間，正常組大鼠正常飲食。模型建立1周后，檢測大鼠血糖值，若血糖大于300 mg/dL即可判斷造模成功[12]。判斷造模成功后，開始給藥。二甲雙胍組大鼠給予腹腔注射二甲雙胍（劑量為10 mg·kg-1·d-1），鳶尾黃素組大鼠給予腹腔注射鳶尾黃素（劑量為300 mg·kg-1·d-1），正常組大鼠給予腹腔注射生理鹽水。共8周。給藥期間，正常組大鼠繼續(xù)正常飲食，其他組別大鼠繼續(xù)給予高糖高脂飼料。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 腎質(zhì)量/體質(zhì)量指數(shù) 給藥結(jié)束后，稱量大鼠質(zhì)量。處死大鼠，采集腎臟組織進(jìn)行稱量。計算腎質(zhì)量/體質(zhì)量指數(shù)。

1.5.2 血糖、糖化血紅蛋白 采用血糖儀檢測大鼠血糖值，全自動糖化血紅蛋白檢測分析儀檢測大鼠糖化血紅蛋白含量。

1. 5. 3 腎功能指標(biāo) 按照試劑盒說明書操作步驟，采用可見分光光度計測定大鼠24hUP、SCr、BUN 水平。在595 nm 波長處測定24hUP吸光度值，在546 nm 波長處測SCr 吸光度值，在640 nm 波長處測定BUN吸光度值。

1. 5. 4 血脂指標(biāo) 按照試劑盒說明書操作步驟，采用可見分光光度計測定大鼠血脂指標(biāo)TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平。在546 nm 波長處測定LDL-C、HDL-C 吸光度值，在510 nm 波長處測定TC、TG吸光度值。

1.5.5 氧化應(yīng)激指標(biāo) 按照試劑盒說明書步驟操作。采用酶標(biāo)儀測定SOD 活性，在450 nm 波長處測定SOD 吸光度值；采用可見分光光度計測定CAT、GSH 活性及MDA 含量，在405 nm 波長處測CAT吸光度值，在420 nm波長處測GSH吸光度值，在532 nm波長處測MDA吸光度值。

1. 5. 6 血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平 采用ELISA 法。在4 ℃下用50 mmol/L 的碳酸鹽包被緩沖液溶解抗原，100 μL/孔（96 孔酶標(biāo)板）。將抗原包被過夜，棄去包被液，用磷酸鹽—Tween-20 磷酸鹽緩沖液（PBST）洗滌3 次，每次5 min。每孔加150 μL 體積分?jǐn)?shù)1%胎牛血清白蛋白（BSA）封閉1 h，PBST 洗滌3 次，加入100 μL 不同倍比稀釋度的血清，并加入對照樣品，37 ℃孵育2 h，PBST洗滌5 次。加入100 μL 稀釋后的HRP 標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌5次后以顯色劑顯色20 min，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測吸光度值。

1. 5. 7 腎組織病理變化 采用HE 染色法。將新鮮腎組織用體積分?jǐn)?shù)10%福爾馬林固定，進(jìn)行石蠟包埋，切片脫蠟，蒸餾水潤濕組織，蘇木素核染色5 min，水洗5 s，伊紅漿染色30 s，水洗后，濾紙吸干，無水乙醇脫水2次后封片。在熒光顯微鏡下觀察腎組織病理表現(xiàn)。

1. 5. 8 腎組織cleaved caspase-3 蛋白表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)法。將腎組織切片先脫蠟處理后用PBST 沖洗2 次，40 g/L 多聚甲醛固定30 min，體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氫化物酶活性，用體積分?jǐn)?shù)10%正常山羊血清在TBS 中孵育30 min。然后用抗cleaved caspase-3 抗體孵育過夜。次日用PBS 沖洗3 次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶（HRP）二抗孵育30 min，室溫下用DBS顯色。熒光顯微鏡下觀察。

1. 5. 9 腎組織P-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表達(dá) 采用Western Blot 法。取大鼠腎組織加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，以12 000 r/min 離心10 min，進(jìn)行總蛋白提取，用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。提取等量的蛋白質(zhì)樣品20 mg，在100 ℃條件下變性5 min。然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，分別加入P-NF-κB p65、NF-κB p65 抗體（1 000 倍稀釋）4 ℃孵育過夜，清洗，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，孵育2 h，最后加入電化學(xué)發(fā)光（ECL）液，曝光處理。應(yīng)用Image J 軟件測量蛋白條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計方法采用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實驗結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。先對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布分析和方差齊性分析，符合條件的選用單因素方差分析或t 檢驗，不符合條件的選用秩和檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎質(zhì)量/體質(zhì)量指數(shù)、血糖值、糖化血紅蛋白水平比較圖2結(jié)果顯示:模型組大鼠腎質(zhì)量/體質(zhì)量指數(shù)，血糖值、糖化血紅蛋白水平顯著高于正常組（P＜0.01）；二甲雙胍組、鳶尾黃素組大鼠腎質(zhì)量/體質(zhì)量指數(shù)、血糖值、糖化血紅蛋白水平顯著低于模型組（P＜0.01），且2 個治療組腎質(zhì)量/體質(zhì)量指數(shù)、血糖值、糖化血紅蛋白水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。

2.2 各組大鼠BUN、SCr、24hUP 水平比較表1結(jié)果顯示:模型組大鼠BUN、SCr、24hUP 水平顯著高于正常組（P＜0.01）；二甲雙胍組、鳶尾黃素組大鼠BUN、SCr、24hUP 水平顯著低于模型組（P＜0.01），且2 個治療組BUN、SCr、24hUP 水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。

圖2 各組大鼠腎質(zhì)量/體質(zhì)量指數(shù)、血糖值、糖化血紅蛋白（HBA1C）水平比較（±s，N=12只）Figure 2 Comparison of renal mass/body mass index，blood glucose value，and glycosylated hemoglobin levels in various groups（±s，N=12）

表1 各組大鼠BUN、SCr、24hUP水平比較Table 1 Comparison of the levels of BUN，SCr，and 24hUP in various groups (±s)

表1 各組大鼠BUN、SCr、24hUP水平比較Table 1 Comparison of the levels of BUN，SCr，and 24hUP in various groups (±s)

①P ＜0.01，與正常組比較；②P ＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組二甲雙胍組鳶尾黃素組N/只12 12 12 12 BUN[（c/mmol?L-1）]5.68±0.89 12.54±1.10①6.54±0.75②7.64±0.97②SCr[c/（μmol?L-1）]88.82±10.35 143.57±20.54①103.32±13.88②110.21±15.39②24hUP[b/（mg?kg-1）]20.31±6.12 186.54±30.25①103.41±21.11②76.87±17.12②

2. 3 各組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平比較表2結(jié)果顯示:與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組、鳶尾黃素組大鼠血清TC、TG、LDL-C 水平顯著降低，HDL-C 水平顯著升高（均P＜0.01），且2 個治療組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。

表2 各組大鼠血清TC、TG、 LDL-C、HDL-C水平比較Table 2 Comparison of the levels of serum TC，TG，LDL-C and HDL-C in various groups[±s，c/（mmol·L-1）]

表2 各組大鼠血清TC、TG、 LDL-C、HDL-C水平比較Table 2 Comparison of the levels of serum TC，TG，LDL-C and HDL-C in various groups[±s，c/（mmol·L-1）]

①P ＜0.01，與正常組比較；②P ＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組二甲雙胍組鳶尾黃素組N/只12 12 12 12 TC 4.35±0.85 10.21±1.14①4.81±0.45②4.34±0.51②TG 1.35±0.10 4.54±0.15①1.53±0.06②1.37±0.05②LDL-C 1.40±0.12 3.31±0.45①1.43±0.09②1.32±0.18②HDL-C 2.12±0.21 1.78±0.09①1.92±0.08②1.89±0.19②

2.4 各組大鼠SOD、CAT、GSH 活性及MDA 含量比較表3結(jié)果顯示:與正常組比較，模型組大鼠血清SOD、CAT、GSH 活性顯著降低，MDA 含量顯著升高（均P＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組、鳶尾黃素組大鼠血清SOD、CAT、GSH 活性顯著升高，MDA 含量顯著降低（均P＜0.01），且2 個治療組SOD、CAT、GSH 活性及MDA 含量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。

表3 各組大鼠SOD、CAT、GSH活性及MDA含量比較Table 3 Comparison of the activity of SOD，CAT and GSH，and MDA content in various groups(±s)

表3 各組大鼠SOD、CAT、GSH活性及MDA含量比較Table 3 Comparison of the activity of SOD，CAT and GSH，and MDA content in various groups(±s)

①P ＜0.01，與正常組比較；②P ＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組二甲雙胍組鳶尾黃素組N/只12 12 12 12 SOD（U/mg prot）89.65±0.00 32.14±3.24①89.61±0.45②93.02±0.51②CAT（U/mg prot）10.35±1.34 3.37±0.05①8.65±0.82②11.04±0.31②GSH（U/mg prot）6.56±0.12 1.02±0.45①5.45±0.09②6.52±0.18②MDA（nmol/mg prot）4.54±0.20 11.78±0.23①7.54±0.18②4.12±0.25②

2.5 各組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較表4結(jié)果顯示:與正常組比較，模型組血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組、鳶尾黃素組血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平顯著降低（P＜0.01），且2 個治療組TNF-α、IL-6、IL-1β 水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。

表4 各組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較Table 4 Comparison of the levels of serum inflammatory cytokines TNF-α，IL-6，IL-1β in various groups [±s，ρ/（ng·mL-1）]

表4 各組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較Table 4 Comparison of the levels of serum inflammatory cytokines TNF-α，IL-6，IL-1β in various groups [±s，ρ/（ng·mL-1）]

①P ＜0.01，與正常組比較；②P ＜0.01，與模型組比較

組別正常組模型組二甲雙胍組鳶尾黃素組N/只12 12 12 12 TNF-α 10.14±1.34 51.31±6.46①25.61±2.54②30.98±3.39②IL-6 12.10±2.51 54.05±5.35①26.32±3.86②35.76±5.06②IL-1β 0.08±0.01 0.64±0.08①0.34±0.03②0.44±0.05②

2.6 各組大鼠腎組織病理表現(xiàn)比較圖3 結(jié)果顯示:與正常組比較，模型組大鼠腎組織表現(xiàn)出明顯的病理損傷，可見腎小球數(shù)量減少，腎小管水腫、擴(kuò)張，空泡化，炎性細(xì)胞浸潤，纖維化，細(xì)胞充血，部分區(qū)域可見蛋白管型。與模型組比較，二甲雙胍組、鳶尾黃素組大鼠腎組織病理損傷程度有所減輕。

2. 7 各組大鼠腎組織cleaved caspase-3 表達(dá)比較圖4 結(jié)果顯示:cleaved caspase-3 的免疫組織化學(xué)陽性染色主要位于細(xì)胞漿內(nèi)，少數(shù)也見于胞核，呈棕褐色。模型組大鼠腎組織cleaved caspase-3 陽性表達(dá)率高于正常組（P＜0.01）；二甲雙胍組、鳶尾黃素組大鼠腎組織cleaved caspase-3 陽性表達(dá)率低于模型組（P＜0.01），且2 個治療組cleaved caspase-3 陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。

圖3 各組大鼠腎組織病理表現(xiàn)比較（HE染色，×400）Figure 3 Comparison of the pathological features of kidney tissue of various groups（by HE staining，×400）

圖4 各組大鼠腎組織cleaved caspase-3表達(dá)比較(±s)Figure 4 Comparison of the expression of cleaved caspase-3 in kidney tissue of various groups(±s)

2.8 各組大鼠腎組織P-NF-κB p65/NF-κB p65 表達(dá)水平比較圖5 結(jié)果顯示: 模型組大鼠腎組織P-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平高于正常組（P＜0.01）；二甲雙胍組、鳶尾黃素組腎組織P-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平低于模型組（P＜0.01），且2個治療組P-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。

3 討論

糖化血紅蛋白是紅細(xì)胞中血紅蛋白與葡萄糖持續(xù)且不可逆地進(jìn)行非酶促蛋白糖基化反應(yīng)的產(chǎn)物，其水平可反映檢測前120 d 內(nèi)的平均血糖水平，是判斷糖尿病患者長期血糖控制情況的良好指標(biāo)[13]。本研究結(jié)果顯示，鳶尾黃素可降低DN 大鼠血糖含量、糖化血紅蛋白水平，表明鳶尾黃素具有降低DN大鼠血糖的作用。

圖5 各組大鼠腎組織P-NF-κB p65/NF-κB p65表達(dá)水平比較(±s)Figure 5 Comparison of the expression levels of P-NFκB/NF-κB p65 in kidney tissue of various groups(±s)

DN 患者的腎功能損害主要以腎功能下降為主要表現(xiàn)，作為常見的反應(yīng)腎臟功能狀態(tài)的指標(biāo)，臨床上可通過檢測BUN、SCr、24hUP 水平，對患者的腎功能進(jìn)行判斷，從而判定患者是否為DN[14]。DN 患者中，BUN、SCr、24hUP 均呈現(xiàn)明顯的升高趨勢[15]。本研究結(jié)果顯示，鳶尾黃素可降低DN 大鼠的BUN、SCr、24hUP 水平及腎質(zhì)量/體質(zhì)量指數(shù)，減輕腎組織病理損傷程度，表明鳶尾黃素有改善DN大鼠腎功能和結(jié)構(gòu)的作用。

脂質(zhì)代謝紊亂被普遍認(rèn)為是糖尿病及其并發(fā)癥的原發(fā)病理生理改變，血脂異常在DN 的發(fā)病機(jī)理中起作用，較低的LDL-C 和TG 水平與從中度白蛋白尿進(jìn)展為嚴(yán)重白蛋白尿或終末期腎病的風(fēng)險降低相關(guān)[16]。TC、TG、LDL-C 和HDL-C 水平的高低是反映胰島素抵抗、氧化應(yīng)激和動脈粥樣硬化的有力指標(biāo)[17]。改善脂質(zhì)代謝是治療DN 的有效方法。LDL-C 水平的持續(xù)升高和HDL-C 水平的降低會導(dǎo)致腎臟形態(tài)和功能的改變[18]。本研究結(jié)果顯示，鳶尾黃素可降低DN 大鼠TC、TG、LDL-C 水平和升高HDL-C 的水平，表明鳶尾黃素可通過改善脂質(zhì)代謝紊亂對DN大鼠腎功能起到保護(hù)作用。

研究[19]證明，抑制炎癥細(xì)胞募集到腎臟中對實驗性DN 具有保護(hù)作用。IL-6是一種26 kDa的細(xì)胞因子，在急性期反應(yīng)物和慢性炎癥的產(chǎn)生中具有調(diào)節(jié)作用，雖然不是典型的炎癥性疾病，但DN現(xiàn)在被認(rèn)為涉及慢性低度炎癥[20]。隨著DN 的進(jìn)展，機(jī)體尿液和血清IL-6增加[21]。IL-1β有助于炎性細(xì)胞募集，TNF-α 是DN 的介質(zhì)，在其發(fā)病機(jī)制中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，鳶尾黃素可降低DN 大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 水平，表明鳶尾黃素可通過降低炎癥因子對DN 大鼠起到保護(hù)腎功能的作用。

氧化應(yīng)激已經(jīng)成為DN 的重要新靶標(biāo)。因過量產(chǎn)生活性氧（ROS）導(dǎo)致的不平衡氧化還原信號傳導(dǎo)加劇了腎損傷。SOD、CAT、GSH 是體內(nèi)抗擊ROS的防線，是評價體內(nèi)氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)[22]。MDA 是前列腺素的代謝產(chǎn)物，高血糖和高血脂會導(dǎo)致脂質(zhì)的過氧化及自由基的增加，促MDA 生成[23]。本研究結(jié)果顯示，鳶尾黃素可升高DN 大鼠SOD、CAT、GSH 活性，降低MDA 含量，表明鳶尾黃素可通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激指標(biāo)對DN 大鼠起到保護(hù)腎功能的作用。

DN 的病因是多因素的，以高血糖、氧化應(yīng)激、晚期糖基化終產(chǎn)物和血管緊張素Ⅱ為主導(dǎo)因子，每一種因素都能激活NF-κB，這是控制宿主表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄因子[24]。NF-κB 可調(diào)節(jié)DN 中的慢性炎癥、纖維化，組織重塑相關(guān)的粘附分子，并促炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)[25]。抑制NFκB可能為DN提供有效的治療選擇[26]。本研究結(jié)果顯示，鳶尾黃素可降低DN 大鼠腎組織P-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平，表明鳶尾黃素可能通過抑制NF-κB通路改善大鼠DN。

Caspase-3 作為凋亡執(zhí)行因子， 其活化后成為cleaved caspase-3 是細(xì)胞凋亡不可逆的標(biāo)志[27]。本研究結(jié)果顯示，鳶尾黃素可降低DN 大鼠腎組織cleaved caspase-3 陽性表達(dá)率，表明鳶尾黃素可通過抑制DN 大鼠腎組織細(xì)胞凋亡起到保護(hù)腎功能的作用。

綜上所述，鳶尾黃素可有效改善DN 幼齡大鼠的高血糖、高血脂、腎組織病理損傷和腎功能異常，其機(jī)制可能與抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激、炎癥因子的釋放和活化、細(xì)胞凋亡等有關(guān)。本研究探討了鳶尾黃素對DN大鼠的治療作用和鳶尾黃素治療DN的潛力，為臨床應(yīng)用鳶尾黃素治療DN 提供了實驗依據(jù)。