高韻， 吳東， 陳子瑜， 陳翠芬， 吳斌

（廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東湛江 524001）

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是慢性炎癥性氣道疾病，是全球發(fā)病率和病死率上升最快的疾病之一[1]。目前，吸入糖皮質(zhì)激素是治療哮喘的主要方案，但效果尚不令人滿意[2]。因此，尋求哮喘的治療藥物仍是基礎(chǔ)和臨床研究中的熱點(diǎn)。中藥虎杖性微寒、味微苦，歸肝、膽、肺經(jīng)，能利濕退黃、清熱解毒、止咳化痰[3]，其在臨床可治療呼吸道感染、肺動(dòng)脈高壓等呼吸系統(tǒng)疾病[4]。白藜蘆醇是虎杖的主要活性成分[5]，具有抗炎[6]、抗腫瘤[7]、抗衰老[8]等作用。腫瘤壞死因子α（TNF-α）是哮喘發(fā)作的重要誘因之一，它能在氣道上皮細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞、 中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)一系列炎癥介質(zhì)的瀑布樣連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致支氣管痙攣，血管通透性增加，誘發(fā)和加重哮喘反應(yīng)[9]。本研究旨在觀察白藜蘆醇對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制，以拓展中藥提取物白藜蘆醇的應(yīng)用價(jià)值，也為臨床應(yīng)用白藜蘆醇治療哮喘奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)人支氣管上皮細(xì)胞株16-HBE獲自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。以含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)。

1. 2 藥物、試劑與儀器白藜蘆醇（批號(hào):R5010100112K5216）、TNF-α（美國(guó)Sigma 公司）。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）（日本同仁化學(xué)研究所）；Perfect Real Time 染料法實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa 公司）；引物購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；核轉(zhuǎn)錄因子κB 抑制蛋白α（IκBα）、磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子κB 抑制蛋白α（p-IκBα）、核轉(zhuǎn)錄因子κB p65（NF-κB p65）、磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子κB p65（p-NF-κB p65）等兔抗（美國(guó)CST 生物公司）。全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（瑞士Roche 公司）；蛋白免疫印跡（Western Blot）轉(zhuǎn)印儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光反應(yīng)試劑盒（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）。

1.3 CCK-8法測(cè)定16-HBE細(xì)胞存活率將16-HBE細(xì)胞以5 × 106個(gè)/孔接種在96 孔板，以0、50、100、150、200 μmol/L 的 白 藜 蘆 醇 分 別 處 理16-HBE細(xì)胞24 h。加入10 mL CCK-8 液37 ℃孵育1 h。應(yīng)用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度（OD，D）值。

1. 4 實(shí)時(shí)定量PCR 法檢測(cè)16-HBE 細(xì)胞中IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA 表達(dá)水平以0、0.5、5、10 ng/mL TNF-α[10]刺激16-HBE 細(xì)胞24 h，或以10 ng/mL TNF-α刺激16-HBE細(xì)胞3、6、18、24 h，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)16-HBE 細(xì)胞中MMP-9、IL-1β、IL-6 mRNA 表達(dá)水平。50、100、150 μmol/L 白藜蘆醇作用于16-HBE 細(xì)胞1 h，再用TNF-α 刺激23 h 后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)16-HBE 細(xì)胞中MMP-9、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)水平。操作步驟:裂解細(xì)胞提取總RNA， 經(jīng)氯仿、異丙醇、乙醇洗滌處理后，應(yīng)用分光光度計(jì)定量D（260 nm）與D（280 nm）。分別取1 μg 總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄一步法，獲得cDNA 產(chǎn)物，進(jìn)行PCR 反應(yīng)。引物序列:IL-6 正義鏈，5’-CCTGAA CCTTCCAAAGATGGC-3’；IL-6 反義鏈，5’-TTC ACCAGGCAAGTCTCCTCA-3’；擴(kuò)展片段長(zhǎng)度75 bp。MMP9 正 義 鏈，5’-TGCATAAGGACGACGTGAAT GGC-3’；MMP9 反義鏈，5’-CTGCGGTGTGGTGG TGGTTG-3’；擴(kuò)展片段長(zhǎng)度89 bp。IL-1β 正義鏈，5’-TTAAAGCCCGCCTGACAGA-3’；IL-1β 反義鏈，5’-GCGAATGACAGAGGGTTTCTTAG-3’；擴(kuò)展片段長(zhǎng)度62 bp。熱循環(huán)條件:95 ℃2 min，40 個(gè)95 ℃循環(huán)10 s，60 ℃循環(huán)30 s。用2-△△Ct相對(duì)定量方法分析檢測(cè)結(jié)果，并以內(nèi)參基因GAPDH 對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行歸一化處理。

1. 5 Western Blot 法 檢 測(cè)16-HBE 細(xì) 胞IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白的表達(dá)以50、100、150 μmol/L 白藜蘆醇分別處理16-HBE 細(xì) 胞1 h，再 用TNF-α 刺 激23 h 后，采 用Western Blot法檢測(cè)16-HBE細(xì)胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65 蛋白的表達(dá)水平。操作步驟:取樣本蛋白定量40 μg 煮沸5 min，通過(guò)十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，轉(zhuǎn)至0.22 μm 聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。新鮮配制的含0.5%Tween20 的TBS 中加入50 g/L脫脂奶粉進(jìn)行封閉， 室溫封閉1 h。分別加入兔抗IκBα 抗體（1∶1 000）、兔抗p-IκBα 抗體（1∶1 000）、兔抗NF-κB p65 抗體（1∶1 000）、兔抗p-NF-κB p65 抗體（1∶1 000）、兔抗GAPDH 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜3 次，加1∶2 000稀釋的生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h。用TBST 洗膜3 遍，上機(jī)掃描圖像、拍照。使用Image J 1.43 軟件對(duì)蛋白條帶灰度進(jìn)行定量，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值（p）表示。

1. 6 統(tǒng)計(jì)方法采用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用Student t 檢驗(yàn)法。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 不同濃度白藜蘆醇對(duì)16-HBE 細(xì)胞活力的影響圖1 結(jié)果顯示，與0 μmol/L 白藜蘆醇組比較，50、100、150、200 μmol/L 白藜蘆醇組細(xì)胞存活率無(wú)明顯變化（P ＞0.05）。提示白藜蘆醇在0 ～200 μmol/L劑量范圍內(nèi)沒(méi)有導(dǎo)致細(xì)胞活力下降，該濃度范圍可用于后續(xù)細(xì)胞研究。

2. 2 TNF-α 對(duì)16-HBE 細(xì) 胞 中IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA表達(dá)的影響圖2結(jié)果顯示:與0 ng/mL TNF-α 組比較，0.5、5、10 ng/mL TNF-α 刺激16-HBE 細(xì)胞24 h 后IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA表達(dá)水平增高，且具有濃度依賴性，其中，10 ng/mL TNF-α 最為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01 或P ＜0.001）；與作用3 h 組比較，10 ng/mL TNF-α刺激16-HBE 細(xì)胞6、18、24 h 后IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA 表達(dá)水平增高，且具有時(shí)間依賴性，其中，24 h 作用最為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01或P ＜0.001）。

圖1 不同濃度白藜蘆醇對(duì)16-HBE細(xì)胞活力的影響(±s)Figure 1 The effects of different concentrations of resveratrol on vability of 16-HBE cells(±s)

2. 3 白藜蘆醇對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的16-HBE 細(xì)胞中IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA 表達(dá)的影響圖3 結(jié)果顯示:與TNF-α 誘導(dǎo)組比較，50、100、150 μmol/L 白藜蘆醇組16-HBE 細(xì)胞中IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA 表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.001），且呈劑量依賴性。

2. 4 白藜蘆醇對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的16-HBE 細(xì)胞中IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響圖4 結(jié)果顯示:與TNF-α 誘導(dǎo)組比較，50、100、150 μmol/L 白藜蘆醇組TNF-α 誘導(dǎo)的16-HBE 細(xì)胞中p-IκBα 蛋白表達(dá)水平增高，且呈劑量依賴性，其中，100、150 μmol/L 白藜蘆醇組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01 或P ＜0.001），而p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.001）。

3 討論

目前，建議以吸入性糖皮質(zhì)激素為基石的階梯式規(guī)范治療哮喘[11]，但其只能使78%的哮喘患者達(dá)到臨床控制，而且需要長(zhǎng)時(shí)間治療，并伴有一系列副作用[12]。盡管多種藥物聯(lián)合使用但仍不能獲得很好的療效，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，并帶來(lái)極大的家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)，因此，迫切需求開(kāi)發(fā)更安全有效的治療藥物。

圖2 TNF-α對(duì)16-HBE細(xì)胞中IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA表達(dá)的影響(±s)Figure 2 The effects of TNF-α on mRNA expression levels of IL-6，MMP-9，IL-1β in 16-HBE cells(±s)

圖3 白藜蘆醇對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的16-HBE細(xì)胞中IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA表達(dá)的影響(±s)Figure 3 The effects of resveratrol on the mRNA expression levels of IL-6，MMP-9 and IL-1β in TNF-α-induced 16-HBE cells(±s)

圖4 白藜蘆醇對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的16-HBE細(xì)胞中IκBα、NF-κB p65 磷酸化的影響(±s)Figure 4 The effects of resveratrol on phosphorylation of IκBα、NF-κB p65 in TNF-α-induced 16-HBE cells(±s)

哮喘是以氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)為主要特征的肺部慢性疾病。有調(diào)查指出91%哮喘主要是由小氣道炎癥引起的[13]。有研究表明，IL-6 能調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞攝取過(guò)敏原、促進(jìn)Th2/Th17 介導(dǎo)的氣道炎癥[14]。IL-1β 參與炎癥小體活化，作為活動(dòng)性過(guò)敏性疾?。ㄈ缦┑纳飿?biāo)志物[15]。MMP-9 由支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮和許多炎癥細(xì)胞產(chǎn)生，能募集炎癥細(xì)胞和產(chǎn)生炎性介質(zhì)[16]。故IL-6、IL-1β、MMP-9等炎癥相關(guān)因子在哮喘氣道炎癥中起著至關(guān)重要的作用。白藜蘆醇是一種藥效學(xué)多樣的多酚類中藥提取物，具有改善細(xì)胞代謝、抗炎等生物效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示:TNF-α能刺激人支氣管上皮細(xì)胞中IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA 過(guò)表達(dá)，24 h 時(shí)最為明顯（P＜0.05）。而經(jīng)過(guò)白藜蘆醇干預(yù)后，TNF-α刺激的人支氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6、MMP-9、IL-1β mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05），表明白藜蘆醇可抑制TNF-α 刺激的人支氣管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

已知NF-κB 蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑在支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中被激活，參與了炎癥反應(yīng)的調(diào)控，其活化需要IκB 激酶的解離以及NF-κB 的核移位等2 個(gè)條件[17]。白藜蘆醇可通過(guò)調(diào)控NF-κB通路起到調(diào)節(jié)炎癥的作用[18-19]。本研究結(jié)果顯示，TNF-α可促進(jìn)16-HBE 細(xì)胞中IκBα的降解和NF-κB的活化，而白藜蘆醇可抑制TNF-α 誘導(dǎo)的16-HBE 細(xì)胞IκBα 的降解和NF-κB 的激活，表明白藜蘆醇可能通過(guò)阻止NF-κB活化來(lái)減輕炎癥反應(yīng)。

綜上所述，白藜蘆醇可抑制TNF-α 誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制NFκB的激活有關(guān)。