劉洋， 鄭彩霞， 韓金花， 孫豐云， 于盼， 張念志

（1.淮北市中醫(yī)醫(yī)院，安徽淮北 235000；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽合肥 230031）

肺纖維化是一類以炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞沉積并伴有肺組織結(jié)構(gòu)破壞為特征的彌漫性病變，既往多從信號(hào)通路、炎癥因子等角度對(duì)其進(jìn)行了探討[1]?；谥嗅t(yī)整體觀念的益氣健脾療法的機(jī)制研究已經(jīng)廣泛地運(yùn)用到防治肺纖維化這一慢性疾病當(dāng)中，但中醫(yī)藥的研究需要多視角、系統(tǒng)地、綜合地進(jìn)行機(jī)制研究。代謝組學(xué)研究方法包含機(jī)體生物代謝的整體信息，與中醫(yī)學(xué)的“整體觀”和“生態(tài)醫(yī)學(xué)觀”非常吻合，為中醫(yī)“證候”本質(zhì)的研究拓展了新思路，是中醫(yī)證候研究的重要方法[2-3]。為此，我們采用代謝組學(xué)技術(shù)，將肺纖維化肺脾氣虛證患者與健康人群對(duì)比，尋找肺脾氣虛證的潛在證候標(biāo)志物，并觀察參苓白術(shù)丸聯(lián)合黃芪顆粒治療肺纖維化肺脾氣虛證患者血漿中潛在證候標(biāo)志代謝物的變化，推測(cè)其體內(nèi)生化過(guò)程和狀態(tài)的變化，揭示參苓白術(shù)丸聯(lián)合黃芪顆粒治療肺纖維化肺脾氣虛證的作用機(jī)制，利用代謝物的終端性信息，為尋找藥物作用的靶點(diǎn)或受體提供臨床指導(dǎo)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2018 年5 月至2019 年1 月在淮北市中醫(yī)醫(yī)院門診就診的23 例肺纖維化肺脾氣虛證患者作為肺纖維化組，另選取20 例健康體檢者作為對(duì)照組，所有受試者均自愿簽署知情同意書(shū)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn):參照2011年特發(fā)性肺纖維化（IPF）診斷和治療循證新指南[4]。中醫(yī)證候標(biāo)準(zhǔn):參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[5]和《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》[6]中的有關(guān)內(nèi)容，中醫(yī)證型為肺脾氣虛型。主要癥狀:喘息，咳嗽，胸悶氣短，畏風(fēng)寒，納差乏力，易汗出或自汗，舌淡苔白，脈浮。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)①符合上述疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)，且1 個(gè)月內(nèi)未使用其他藥物治療；②年齡在45～65 歲；③處于肺纖維化穩(wěn)定期；④自愿參加本研究并簽署知情同意書(shū)的患者。

1. 4 排除標(biāo)準(zhǔn)①有明確職業(yè)病史（塵肺、矽肺）、藥物史（胺碘酮）等原因引起的肺間質(zhì)性疾病患者；②有嚴(yán)重心肝腎功能損害的患者；③有其他嚴(yán)重疾病的患者；④依從性差，未按規(guī)定接受治療，從而影響療效判定的患者。

1.5 治療方法

1.5.1 治療組 給予參苓白術(shù)丸聯(lián)合黃芪顆粒治療。（1）參苓白術(shù)丸（主要成分:人參、炒白術(shù)、陳皮、茯苓、山藥、砂仁、桔梗等；由河南宛西制藥有限公司生產(chǎn)， 批準(zhǔn)文號(hào): 國(guó)藥準(zhǔn)字Z8121003），口服，每次4 丸，每日3 次。（2）黃芪顆粒（貴州漢方藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字Z19993254），沖服，每次2 袋（每袋相當(dāng)于中藥飲片黃芪15 g），每日2 次，2 個(gè)月為1 個(gè)療程。

1.5.2 對(duì)照組 不給予任何干預(yù)治療。

1.6 觀察指標(biāo)與標(biāo)本檢測(cè)

1.6.1 中醫(yī)證候評(píng)分 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[5]，結(jié)合臨床實(shí)際制定。主要包括喘息、咳嗽、自汗、乏力等4 項(xiàng)，根據(jù)程度分為無(wú)、輕、中、重4級(jí)，分別計(jì)為0、1、2、3分。

1.6.2 標(biāo)本檢測(cè)方法

1.6.2.1 標(biāo)本采集 對(duì)照組抽取靜脈血4 mL，肺纖維化組于治療前和治療后各抽取靜脈血4 mL，2 組血液樣本以3 000 r/min的速度離心15 min（溫度小于4 ℃），取上清液留存于-70℃冰箱待用。

1. 6. 2. 2 標(biāo)本制備 檢測(cè)前將所有血漿樣本4℃解融，乙腈、蒸餾水預(yù)冷8 h。乙腈/血漿樣本為3∶1比例（3 000 μL/1 000 μL）進(jìn)行蛋白沉淀，渦旋混勻；以15 000 r/min 離心10 min，取上清液，與乙腈、蒸餾水按1∶1∶3稀釋，移入液相瓶中待測(cè)。

1.6.2.3 樣本質(zhì)量控制 各組樣本4 ℃解融，渦旋混勻，分別吸取100 μL 血清，再次渦旋混勻后分裝于EP管中。其余處理同本方法。

1.6.2.4 液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）檢測(cè) 在安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥藥理實(shí)驗(yàn)室采用HPLC-MS 和AB SCIEX Q-Triple 4500 System檢測(cè)分析。色譜柱:Shim-pakISC-07/S1504Li（150 mm × 4.0 mm）；流速:0.5 mL/min；進(jìn)樣量:10 μL；柱溫:40 ℃；流動(dòng)相:A:將蒸餾水和乙腈按照19∶1 的比例配置，并加入600 μL 乙酸溶液和5 mL 乙酸銨。B:將乙腈和蒸餾水按照19∶1 的比例配置，并加入600 μL 乙酸溶液和5 mL 乙酸銨。梯度洗脫條件如下:先加入2%乙腈，20 min內(nèi)增加至95%乙腈，在2 min 內(nèi)降至3%并維持5 min，后運(yùn)行時(shí)間設(shè)為5 min；流速為0.5 mL/min；樣本體積為5 μL。

1. 6. 2. 5 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI）正離子模式檢測(cè)，質(zhì)譜檢測(cè)范圍:質(zhì)荷比（m/z）100 ～1 200 Da；CUR:40.0 psi；CAD High Ion Spray VoHage: 5 000 V；DP:80 V；EP:20 V；CE:10 eV；TEM:600 ℃。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法及數(shù)據(jù)處理

1.7.1 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7.2 數(shù)據(jù)處理 （1）本研究采用美國(guó)AB 公司的markerview 1.2.1 代謝組學(xué)分析軟件對(duì)歸一化的數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)建模分析，輸出形式為載荷圖[7]。載荷圖中的每一個(gè)點(diǎn)表示一個(gè)代謝區(qū)域，處于病理狀態(tài)的樣本在散點(diǎn)分布處于相似的位置；載荷圖上每一個(gè)點(diǎn)表示代謝物的相關(guān)信息，距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，表示其病理生理狀態(tài)差距越大，對(duì)不同組間的分離貢獻(xiàn)亦越大[8]。（2）利用SIMCA V14.1 代謝組學(xué)分析軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（PCA）正交偏最小二乘法—判別分析（OPLS-DA），最大化顯示模型與主成分相關(guān)差異。利用OPLS-DA 模型變量因子（VIP＞1，t 檢驗(yàn)，P＜0.05）的條件進(jìn)行質(zhì)荷比篩選和尋找差異性代謝物，通過(guò)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)（http://metlin.scripps.edu/、www.hmdb.ca/metabolites、KEGG、LIPID）定性可能的差異代謝物，推測(cè)代謝物種類，對(duì)差異性代謝物進(jìn)行分析，從而找到與代謝差異物相關(guān)性最高的通路所在。

2 結(jié)果

2.1 肺纖維化組與對(duì)照組的基線資料比較肺纖維化組23 例受試者中，男14 例，女9 例；年齡56～65 歲，平均（58.06±6.82）歲。對(duì)照組20 例受試者中，男15 例，女5 例；年齡51～63 歲，平均（53.06±7.82）歲。2 組受試者的年齡、性別比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 肺纖維化組患者治療前后各項(xiàng)中醫(yī)證候評(píng)分比較表1 結(jié)果顯示:治療2 個(gè)月后，肺纖維化組患者喘息、咳嗽、自汗、 乏力評(píng)分均較治療前明顯改善，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 肺纖維化組患者治療前后各項(xiàng)中醫(yī)證候評(píng)分比較Table 1 Comparison of TCM syndrome scores in the case group before and after treatment（±s，s/分）

表1 肺纖維化組患者治療前后各項(xiàng)中醫(yī)證候評(píng)分比較Table 1 Comparison of TCM syndrome scores in the case group before and after treatment（±s，s/分）

①P＜0.01，與治療前比較

時(shí)間治療前治療后N/例23 23喘息2.95±1.34 0.11±0.03①咳嗽1.95±0.61 0.37±0.22①自汗2.05±0.52 0.83±0.41①乏力2.05±0.66 0.71±0.57①

2.3 肺纖維化組患者治療前后和對(duì)照組的血漿代謝物PCA 圖PCA 圖能反映各組樣本代謝差異和組內(nèi)樣本之間的變異度大小。分析模型參數(shù)為R2X，其值大于0.4 表示可靠。2 組共計(jì)獲得8 個(gè)主要成分，共計(jì)R2X=0.652。從圖1 可看出，肺纖維化組與對(duì)照組代謝物分別處于不同區(qū)域，有顯著性差異。

圖1 肺纖維化組治療前后和對(duì)照組的血漿代謝物PCA圖Figure 1 PCA results for the plasma differential metabolites in the case group before and after treatment and in the control group

2.4 肺纖維化組患者治療前后和對(duì)照組的血漿代謝物OPLS載荷圖采用OPLS對(duì)2組樣本獲得差異性代謝物信息，模型參數(shù):R2X 值為0.473，R2Y值為0.983、Q2值為0.876，提示該模型穩(wěn)定且可信度高。圖2 載荷圖中的圓點(diǎn)（X）代表了所有差異性代謝物，載荷圖左右兩端的物質(zhì)是潛在的差異標(biāo)志物。距離藍(lán)色三角（Y）越近，其變異量也越大，而這些大的變異量在樣本分類中起決定性的作用。治療后肺纖維化組代謝物同對(duì)照組融合交織，與治療前相比差異顯著，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 肺纖維化組治療前和對(duì)照組的血漿代謝物OPLS載荷圖Figure 2 OPLS load chart for the plasma differential metabolites in the case group before treatment and in the control group

圖3 肺纖維化組治療后和對(duì)照組的血漿代謝物OPLS載荷圖Figure 3 OPLS load chart for the plasma differential metabolites in the case group after treatment and in the control group

2.5 潛在證候標(biāo)志代謝物治療前后變化趨勢(shì)結(jié)合重要變量因子VIP值，借助（KEGG、LIPID）等相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)t 檢驗(yàn)選出差異變量，通過(guò)對(duì)肺纖維化組治療前后差異性代謝物，推測(cè)出在正離子模式下，磷脂酰膽堿、溶血磷脂酸、基質(zhì)金屬蛋白酶1、白三烯4、脂氧素15-epi-LXB4、15-羥基二十碳四烯酸6種物質(zhì)為肺纖維化組干預(yù)后的差異性代謝物。表2 顯示肺纖維化組治療后磷脂酰膽堿、溶血磷脂酸、脂氧素15-epi-LXB4、白三烯4 等成分較治療前下降，趨向于健康對(duì)照組水平。

表2 潛在證候標(biāo)志代謝物變化趨勢(shì)Table 2 Tendency of the changes in the potential syndrome marker metabolites

2.6 肺纖維化組治療前后與對(duì)照組血漿差異性代謝物的代謝通路如圖4所示，每一個(gè)氣泡代表一個(gè)代謝通路，氣泡所在橫坐標(biāo)和氣泡大小表示該通路在拓?fù)浞治鲋械挠绊懸蜃哟笮。瑲馀菰酱笥绊懸蜃釉酱?；氣泡所在的縱坐標(biāo)和氣泡顏色表示富集分析的P 值（-log10P-value），顏色越深，P 值越小，富集程度越顯著。如圖4、5 所示，肺纖維化組治療前所涉及的主要異常代謝通路為神經(jīng)酰胺酶代謝、磷脂酶代謝、谷胱甘肽代謝、α-亞麻酸代謝、鯊烯代謝、二十四烷酸代謝；治療后的代謝通路為神經(jīng)酰胺酶代謝、磷脂酶代謝。

圖4 肺纖維化組治療前與對(duì)照組血漿差異性代謝物的代謝通路圖Figure 4 The main metabolic pathways of plasma differential metabolites in the case group before treatment and in the control group

圖5 肺纖維化組治療后與對(duì)照組血漿差異性代謝物的代謝通路圖Figure 5 The main metabolic pathways of plasma differential metabolites in the case group after treatment and in the control group

3 討論

肺纖維化治療缺乏特效藥物，目前大多采用糖皮質(zhì)激素或聯(lián)合細(xì)胞毒藥物治療，存在一定的不良反應(yīng)，而中醫(yī)藥以其多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，在提高療效、改善生活質(zhì)量、減輕毒副作用上有較好療效。肺纖維化屬中醫(yī)“肺痿”范疇，是由于肺氣虛弱、氣不布津而導(dǎo)致的以咳吐濁唾涎沫為主癥的一類疾病，研究[9]證實(shí)其基本證型以肺氣虛證為主，治療也多以益氣為主，再結(jié)合辨證給予化痰健脾祛濕為法。參苓白術(shù)丸出自宋代《太平惠民和劑局方》，具有益氣健脾、祛濕之功效，為“培土生金”治法的常用方劑；而黃芪具有補(bǔ)肺氣之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，方中的主要成分人參皂苷具抗疲勞、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能作用[10]；而黃芪顆粒中的黃芪多糖能升高白細(xì)胞，提高網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能，激活T 細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞等免疫細(xì)胞活性[11]。本研究結(jié)果顯示，肺纖維化組患者治療后的各項(xiàng)中醫(yī)證候評(píng)分均較治療前明顯改善，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），表明參苓白術(shù)丸聯(lián)合黃芪顆粒能顯著改善肺纖維化患者肺脾氣虛證的臨床癥狀。

中醫(yī)方劑對(duì)應(yīng)的是證候或病，發(fā)現(xiàn)證候/病的生物標(biāo)志物，建立臨床療效的生物評(píng)價(jià)體系是評(píng)價(jià)方劑臨床療效進(jìn)而發(fā)現(xiàn)中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的基本前提[12]。中醫(yī)方證代謝組學(xué)以中醫(yī)證候/病的本質(zhì)研究為起點(diǎn)，通過(guò)方劑內(nèi)顯效成分和相關(guān)代謝標(biāo)志物的關(guān)聯(lián)性，從而為深入了解疾病的發(fā)病過(guò)程提供理論依據(jù)，為疾病診斷及評(píng)價(jià)藥物療效提供指導(dǎo)，是體現(xiàn)中藥復(fù)方配伍的有效性方案[13]。張淼等[14]研究發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒感染導(dǎo)致的獲得性免疫缺陷綜合征（HIV/AIDS）肺脾氣虛證患者存在脂代謝異常表現(xiàn)，血清中載脂蛋白（ApoA2）、甘油三酯（TG）升高，ApoB、人鋅α2 糖蛋白（AZGP1）降低，血脂表現(xiàn)異常，證實(shí)ApoA2、ApoB、AZGP1、TG 為HIV/AIDS 肺脾氣虛證的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。以上研究證實(shí)差異代謝物可反映病理所對(duì)應(yīng)的代謝異常物質(zhì)和功能的改變，并能確定其代謝通路的異常，表明代謝組學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論相結(jié)合有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究顯示，肺纖維化組（PCA 圖）在治療后向健康對(duì)照組融合回歸，2 組代謝物質(zhì)類似，表明參苓白術(shù)丸聯(lián)合黃芪顆粒治療肺纖維化肺脾氣虛證有顯著臨床療效。肺纖維化組治療后磷脂酰膽堿、溶血磷脂酸、脂氧素15-epi-LXB4、白三烯4等成分較治療前下降，趨向于對(duì)照組水平。說(shuō)明參苓白術(shù)丸聯(lián)合黃芪顆粒干預(yù)治療后，患者的病情得到一定程度恢復(fù)，反映了其作為潛在證候標(biāo)志代謝物的可靠性，進(jìn)而推測(cè)出參苓白術(shù)丸聯(lián)合黃芪顆粒治療可通過(guò)下調(diào)磷脂酰膽堿、溶血磷脂酸、脂氧素15-epi-LXB4、白三烯4 等代謝物質(zhì)而發(fā)揮治療作用，其中對(duì)脂類代謝物質(zhì)（磷脂酰膽堿、溶血磷脂酸、脂氧素15-epi-LXB4）改善顯著，表明脂類代謝異常與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系，因此結(jié)合相關(guān)的脂類變化，找到異常的代謝通路，識(shí)別脂類生物標(biāo)志物，對(duì)肺纖維化的病因及治療提供指導(dǎo)以及提供新的藥物治療靶點(diǎn)，從而進(jìn)一步提高臨床療效。肺纖維化組治療后的代謝通路為神經(jīng)酰胺酶代謝、磷脂酶代謝為代表的鞘磷脂類代謝為主，表明參苓白術(shù)丸聯(lián)合黃芪顆粒通過(guò)神經(jīng)酰胺酶、磷脂酶通路參與改善肺纖維化發(fā)病過(guò)程，神經(jīng)酰胺酶、磷脂酶類代謝通路的差異性是肺纖維化炎癥等癥狀存在的基礎(chǔ)，進(jìn)一步證實(shí)了以神經(jīng)酰胺酶、磷脂酶為代表的鞘磷脂類代謝通路的差異性是參與肺纖維化疾病發(fā)展過(guò)程中的主要通路所在。大量研究[15]表明，脂類代謝異常與呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，鞘磷脂主要位于細(xì)胞膜和脂蛋白中，主要參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、凋亡等過(guò)程。有證據(jù)[16-17]表明，鞘磷脂類信號(hào)通路在肺纖維化的發(fā)病中起著重要作用，鞘磷脂參與肺纖維化疾病主要是受到神經(jīng)酰胺水平的調(diào)控，機(jī)體在氧化應(yīng)激的情況下誘導(dǎo)鞘磷脂酶活化及產(chǎn)生神經(jīng)酰胺從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生，鞘磷脂酶抑制劑可能成為一類新的藥物在防治肺纖維化中發(fā)揮重要作用。因此，基于中醫(yī)方證對(duì)應(yīng)療效的專屬性，利用中醫(yī)證候代謝組學(xué)，識(shí)別脂類生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)異常的代謝通路，建立方劑藥效生物評(píng)價(jià)體系，能夠深入揭示肺纖維化的發(fā)病機(jī)制和提供新的藥物治療靶點(diǎn)，進(jìn)而指導(dǎo)臨床用藥。