王繼元

（天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300000）

1 引言

番茄（Lycopersicon esculentum Mill，茄科）又名西紅柿 ，，作為世界上蔬菜需求中最多的菜品之一，在世界市場(chǎng)上有廣泛的消費(fèi)群體[1]。同時(shí)也是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，因其獨(dú)特的風(fēng)味，極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，在日常生活中，番茄也可當(dāng)水果食用[2]。

1.1 番茄灰霉病研究狀況

番茄灰霉病（Botrytis cinerea）是令番茄減產(chǎn)的重要病害之一， 特別是早春大棚栽培的番茄， 因常遇低溫高濕的天氣，導(dǎo)致病害嚴(yán)重發(fā)生[3]。隨著現(xiàn)代塑料大棚蔬菜生產(chǎn)的迅速發(fā)展，保護(hù)地蔬菜栽培面積的不斷擴(kuò)大， 此類(lèi)病害逐年上升， 每年減產(chǎn)20 %- 30 %，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50 %。

1.1.1 番茄灰霉病主要病原菌、發(fā)病癥狀和致病因素

番茄灰霉病病原為真菌門(mén)（Eumycophyta），半知菌亞門(mén)（Deuteromycotina）， 絲 孢 綱（Hyphomycetes）， 叢 梗 孢 目（Moniliales），叢梗孢科，葡萄孢屬（Botrytis cinerea）的灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。

番茄灰霉病發(fā)病癥狀為：番茄部分葉、莖、果實(shí)都出現(xiàn)病害。葉片的發(fā)病部位成灰褐色“V” 字形病斑，表面生有灰白色的霉層；莖部多發(fā)生在分枝處或基部，有水漬狀斑點(diǎn)或淡褐色大斑，嚴(yán)重的繞莖一周，病枝折斷；果實(shí)腐爛，密生灰色霉層，傳播速度快，爛果很多[5]。

1.1.2 番茄灰霉病的防治

國(guó)內(nèi)外學(xué)者十分重視番茄灰霉病的防治工作，并做了大量系統(tǒng)的研究[7]，并且在實(shí)踐中已取得了一定的進(jìn)展。但是，目前生產(chǎn)上仍然缺乏防治該病的有效辦法?，F(xiàn)在主要使用的防治手段有化學(xué)用藥、物理防治和生物防治?；瘜W(xué)用藥可分為預(yù)防用藥以及治療用藥；物理防治包括種子臭氧滅菌處理、大劑量臭氧空棚滅菌和采用RTBF-300 病害防治機(jī)；生物防治主要利用拮抗微生物對(duì)番茄灰霉病發(fā)生前進(jìn)行防治[6]。

1.2 拮抗菌的應(yīng)用及現(xiàn)狀

拮抗菌能夠產(chǎn)生一些拮抗物質(zhì)，比如細(xì)菌素等，這些產(chǎn)生的物質(zhì)能夠抑制或者直接殺死病原微生物。拮抗菌抑制病原微生物的重要機(jī)理之一是其具有抗生作用。目前，抗生素的應(yīng)用比較廣泛，對(duì)黃瓜疫病、泡桐腐爛病、楊樹(shù)爛皮病和白菜霜霉病等病害有較良好的防治效果。

1.3 本試驗(yàn)的目的和意義

番茄是世界蔬菜需求量最多的菜品之一，同時(shí)也是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。番茄灰霉病會(huì)直接導(dǎo)致番茄產(chǎn)量的銳減，利用生物防治手段來(lái)防治番茄灰霉病的發(fā)生，有利于生態(tài)環(huán)境的保持以及農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，因?yàn)樯锓乐问侄问峭ㄟ^(guò)利用微生物中具有的拮抗作用來(lái)抑制有害菌類(lèi)發(fā)生，由于利用拮抗作用來(lái)防治病害幾乎不產(chǎn)生副作用，不污染環(huán)境，所以利用拮抗菌進(jìn)行生物防治具有較大的應(yīng)用潛力。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

2.1.1 土壤樣品采集

本試驗(yàn)所使用10 個(gè)不同地區(qū)所采集的土壤樣品，進(jìn)行番茄灰霉拮抗菌的篩選。

2.1.2 試驗(yàn)主要試劑及儀器

LB 培養(yǎng)基：

蛋白胨 10 g 酵母粉 5.0 g 氯化鈉（NaCl） 10 g

蒸餾水 1000 ml PH 7.5

混勻后每支試管加入5ml（固體LB 需每100ml 添加1.6g瓊脂粉末）121 ℃高壓滅菌20min

（1）PDB 培養(yǎng)基：

新鮮馬鈴薯 200g 蔗糖 20.0g 蒸餾水 1000ml

混勻后（PDA 培養(yǎng)基需每100ml 添加1.6g 瓊脂粉末）121 ℃高壓滅菌20 min

（2）察氏培養(yǎng)基：

硝酸鈉（NaNO3） 3.0 g 磷酸氫二鉀（K2HPO4） 1.0 g

七水硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.5 g 氯化鉀（KCl） 0.5 g

硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O） 0.01 g 蔗糖 30 g

混勻后121 ℃高壓滅菌20 min。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 試驗(yàn)樣品菌株的分離與純化

采集不同地區(qū)新鮮土樣10 份，采集時(shí)注意采集根際土壤，將不同地區(qū)采集圖樣標(biāo)記編號(hào)。取各編號(hào)土樣1 份，進(jìn)行研磨，至土樣細(xì)膩為止，過(guò)400 目篩子，取篩后土樣各0.5 g，溶于含50 ml 0.85 % 生理鹽水的錐形瓶中，用封口膜封上并將其置于180rpm/min 37℃的搖床上20min（使土壤中微生物充分溶于生理鹽水中）。

2.2.2 番茄灰霉病拮抗菌的篩選

將得到的差異菌株，與番茄灰霉病病菌進(jìn)行平板對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)。在固體PDA 平板培養(yǎng)基中心接種番茄灰霉菌餅，在四周對(duì)稱(chēng)接種所篩選出的差異菌株（每組三次重復(fù)），每個(gè)平板可以接4-6 個(gè)點(diǎn)（可接差異菌株），置于真菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察是否存在抑菌圈，篩選出對(duì)番茄灰霉具有較明顯拮抗作用的菌株，再單獨(dú)進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)。

2.2.3 番茄灰霉病拮抗菌形態(tài)的觀察

相同培養(yǎng)基在相同的培養(yǎng)條件下，不同菌種的生長(zhǎng)特性是各自不同的，因此根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色以及生長(zhǎng)時(shí)間來(lái)鑒定菌種。試驗(yàn)過(guò)程中，我們沾取新長(zhǎng)出的細(xì)菌的菌體畫(huà)線接種于LB 培養(yǎng)基中；真菌挑取菌絲用劃線法接種在PDA 培養(yǎng)基中，將其分別置于細(xì)菌培養(yǎng)箱（29 ℃）和真菌培養(yǎng)箱（25 ℃）中培養(yǎng)，并觀察菌落的特征形態(tài)，記錄數(shù)據(jù)。

2.2.4 番茄灰霉病拮抗菌的分子鑒定

使用北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒按照說(shuō)明步驟進(jìn)行了細(xì)菌株基因組的提取，并將提取所得DNA 模版進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2.2.5 番茄灰霉拮抗菌的生理生化鑒定

2.2.5.1 唯一碳源利用

選取草酸、半乳糖、核糖、L-樹(shù)膠醛糖、淀粉、肌醇、精氨酸、檸檬酸、蔗糖、木糖、麥芽糖、甘露醇、D- 海藻糖、甘露糖、葡萄糖、山梨醇、鼠李糖、果糖、糖原等藥品進(jìn)行碳源利用試驗(yàn)。

2.2.5.2 糖、醇發(fā)酵產(chǎn)酸

選取木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖、鼠李糖、山梨醇、甘露醇、L- 樹(shù)膠醛糖、淀粉、蔗糖、D- 海藻糖、肌醇、果糖、麥芽糖、等藥品進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2.5.3 精氨酸雙水解酶

培養(yǎng)基：蛋白質(zhì) 1.0 g；酚紅 0.01 g；NaCl 5.0 g；瓊脂 6.0 g；L- 精氨酸鹽 10.0 g；K2HPO40.3 g；蒸餾水 1000 ml

調(diào)節(jié)PH 到 7.0-7.2 之間，分裝試管（每支試管5 mL），建立對(duì)照組，121 ℃下滅菌20 min。

3 結(jié)果與分析

3.1 試驗(yàn)土壤樣品中菌株分離、純化

經(jīng)過(guò)對(duì)土樣的分離及純化，從10 份土壤樣品中分離出差異菌株29 株，其中細(xì)菌25 株，真菌4 株，依次對(duì)其進(jìn)行編號(hào)。細(xì)菌為：WJY-1 至WJY-25；真菌為WJY-Z1 至WJY-Z4。

3.2 番茄灰霉病拮抗菌的篩選

通過(guò)與番茄灰霉病菌對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)，篩選得到6 株（編號(hào)依 次 為：WJY-1，WJY-2，WJY-3，WJY-7，WJY-8，WJY-9）有拮抗作用的細(xì)菌。注：“＋” 代表陽(yáng)性，“－” 代表陰性。

4 討論

4.1 番茄灰霉病拮抗菌的篩選

因?yàn)槭褂没瘜W(xué)手段對(duì)番茄灰霉病進(jìn)行防治，會(huì)產(chǎn)生大量的藥物殘留，破壞生態(tài)環(huán)境等一系列問(wèn)題。但是使用拮抗細(xì)菌進(jìn)行防治幾乎不會(huì)產(chǎn)生這些問(wèn)題，因此對(duì)拮抗菌的研究與應(yīng)用已成為目前研究熱點(diǎn)之一。芽孢桿菌是目前拮抗菌研究的主要菌屬之一，其種類(lèi)繁多，對(duì)外界環(huán)境具有極強(qiáng)的適應(yīng)能力，并可產(chǎn)生抗逆性的芽孢，在其代謝物質(zhì)中有多種的活性抑菌物質(zhì)存在，具有較大的抑菌范圍，對(duì)部分農(nóng)作物有一定的促生作用，具有良好的應(yīng)用前景。

4.2 菌種鑒定

傳統(tǒng)的微生物鑒定手段，主要是通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合生理生化試驗(yàn)結(jié)果對(duì)細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定。但由于微生物種間的差異有時(shí)并不顯著，而且在不同的生存環(huán)境下，相似的菌類(lèi)一樣可能產(chǎn)生不同的生長(zhǎng)現(xiàn)象，從而導(dǎo)致不同的生理生化現(xiàn)象，這就造成菌種鑒定中存在誤差。隨著現(xiàn)代的分子生物學(xué)的發(fā)展，可以進(jìn)一步削弱此類(lèi)問(wèn)題。

4.3 篩選所得拮抗菌抑病效果

拮抗菌的作用機(jī)理較為復(fù)雜，其與環(huán)境因素存在緊密的關(guān)系，當(dāng)外界環(huán)境不適于其生長(zhǎng)時(shí)，甚至都不會(huì)表現(xiàn)出其拮抗作用甚至死亡。在試驗(yàn)室充足的環(huán)境條件下單一菌株也會(huì)存在易退化現(xiàn)象，單一菌株對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力較弱，在不同的環(huán)境中往往并不能表現(xiàn)出試驗(yàn)室內(nèi)的試驗(yàn)結(jié)果以及現(xiàn)象。

5 結(jié)論

在我國(guó)，番茄灰霉病可導(dǎo)致番茄每年減產(chǎn)20 %-30 %，已經(jīng)成為番茄種植過(guò)程中面臨的重大問(wèn)題之一。在蕃茄灰霉病防治過(guò)程中，由于拮抗菌防治病害專(zhuān)一性強(qiáng)，無(wú)毒害，無(wú)污染已在世界范圍廣泛使用。