韓曉娟，陳礴，侯海文

急性心肌梗死（AMI）是冠狀動(dòng)脈閉塞或嚴(yán)重狹窄導(dǎo)致大量心肌細(xì)胞急劇缺血、缺氧引發(fā)細(xì)胞壞死的疾病，該病發(fā)病急，病情重，病情變化快，嚴(yán)重影響患者的生命健康與生活質(zhì)量，AMI已成為我國(guó)居民首位死因[1-3]。AMI再灌注治療后，患者極易并發(fā)心肌缺血再灌注損傷及心室重構(gòu)，嚴(yán)重影響了AMI患者的臨床治療療效及患者的預(yù)后。研究表明，心肌細(xì)胞凋亡是AMI及心肌缺血再灌注損傷的一個(gè)重要病理改變[4]。丹參素（Danshensu）是丹參中的主要有效成分，是已被證實(shí)的治療冠心病的重要活性成分[5]。丹參素具有擴(kuò)張血管，增加冠狀動(dòng)脈血流量，增強(qiáng)組織抗缺氧能力，減輕炎癥反應(yīng)等作用。丹參素可改善心肌缺血再灌注后的心臟功能障礙，縮小心肌梗死面積，研究表明，丹參素在急性腦梗死、冠心病及心絞痛等治療中具有顯著作用[6]。通過(guò)本研究通過(guò)給予丹參素治療心肌梗死大鼠，以探討丹參素對(duì)AMI心肌損傷的保護(hù)作用，為臨床治療急性心肌梗死提供新的思路和參考。

1 材料與方法

1.1 心肌梗死大鼠模型的建立清潔級(jí)健康SD大鼠，45只，雄性，體重220～260 g，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（陜）2014-002。已通過(guò)我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查。在腹腔行10%的水合氯醛，0.3 ml/100 g水合氯醛、嗎啡（6 mg/kg，皮下注射）麻醉大鼠。在大鼠胸部正中偏左側(cè)切口露出大鼠心臟，在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間，以5-0無(wú)創(chuàng)縫合線穿過(guò)前降支（LAD）并結(jié)扎。觀察心電圖，心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段明顯升高， 肉眼觀察結(jié)扎區(qū)域變白作為模型成功的標(biāo)志，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中維持機(jī)械呼吸支持。心臟復(fù)位關(guān)胸，然后縫合皮膚。

SD大鼠造模成功24 h后，丹參素組給予經(jīng)尾靜脈注射2 mg/kg丹參素注射液，連續(xù)7 d；對(duì)照組和模型組給予等劑量生理鹽水。

1.2 心肌梗死組織形態(tài)學(xué)檢查HE染色檢測(cè)：取大鼠心肌組織石蠟切片標(biāo)本（5 μm/張）常規(guī)進(jìn)行蘇木精和伊紅液染色，觀察HE染色大鼠心肌病理改變結(jié)果。

心肌梗死面積檢測(cè)：取大鼠心肌組織冰凍切片，置于2% TTC 37℃孵育15 min，用多聚甲醛固定后進(jìn)行數(shù)碼相機(jī)拍照 用Image ProPlus圖像分析系統(tǒng)測(cè)量各組大鼠心肌梗死面積，梗死面積（%）＝ 梗死區(qū) /（梗死區(qū)＋缺血區(qū)）×100%。TTC染色后，白色區(qū)域代表心肌梗死區(qū)（AN），紅色區(qū)域代表心肌缺血，藍(lán)色區(qū)域代表正常區(qū)。

1.3 免疫組織化學(xué)法染色取鼠心肌組織石蠟切片標(biāo)本（5 μm/張），加入5%血清進(jìn)行室溫封閉（40 min），加入一抗SIRT1和二抗孵育。清洗后加入SP和DAB試劑盒。封片后用顯微鏡進(jìn)行觀察。SIRT1陽(yáng)性表達(dá)表現(xiàn)：在心肌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。

1.4 ELISA法檢測(cè)IL-6 和 TNF-α表達(dá)離心大鼠心肌組織提取蛋白，采用ELISA法測(cè)定大鼠心肌組織TNF-α和IL-6的含量，試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司。

1.5 WesternBlot檢測(cè)SIRT1、TLR4、NF-κB、Bcl-2、Caspase3蛋白表達(dá)水平離心大鼠心肌組織提取蛋白（蛋白濃度總量為30 μg/μl）。各組大鼠心肌組織蛋白樣品常規(guī)進(jìn)行凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜，加入大鼠多克隆抗體SIRT1、TLR4、NFκB、Bcl-2、Caspase3和二抗。顯色使用ECL顯色劑，用Quantity-one軟件進(jìn)行蛋白分析。以目的條帶與內(nèi)參β-actin 條帶灰度值比值評(píng)定蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果光鏡下可見心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征基本正常，心肌纖維排列整齊勻稱，偶有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組可見心肌纖維結(jié)構(gòu)破壞、排列紊亂，心肌纖維增粗、纖維組織廣泛增生；大量心肌細(xì)胞核濃縮、變小或變性，心肌間質(zhì)充血、水腫，可見大量心肌壞死灶及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等。丹參素組可見心肌纖維增粗、心肌纖維排列相對(duì)整齊，心肌細(xì)胞較少量的變性、心肌組織水腫恢復(fù)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，病變程度逐漸恢復(fù)（圖1）。

圖1 HE染色結(jié)果（×20）

2.2 免疫組化染色結(jié)果與對(duì)照組大鼠SIRT1表達(dá)平均光密度相比，模型組SIRT1表達(dá)平均光密度顯著降低，丹參素組顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，丹參素組SIRT1表達(dá)平均光密度顯著升高（P＜0.05）（圖2）。

圖2 免疫組化染色結(jié)果（×20）

2.3 心肌梗死面積測(cè)定與對(duì)照組大鼠心肌梗死面積相比，模型組和丹參素組大鼠心肌梗死面積顯著增大（P＜0.05）。丹參素組大鼠心肌梗死面積比模型組顯著減少（P＜0.05）（圖3）。

圖3 心肌梗死面積測(cè)定

2.4 ELISA測(cè)定IL-6 和 TNF-α表達(dá)與對(duì)照組大鼠心肌梗死面積相比，模型組和丹參素組大鼠IL-6 和 TNF-α表達(dá)顯著增多（P＜0.05）。與模型組相比，丹參素組IL-6 和 TNF-α表達(dá)顯著降低（P＜0.05）（圖4）。

圖4 ELISA 測(cè)定IL-6和TNF-α表達(dá)

2.5 蛋白表達(dá)水平測(cè)定與對(duì)照組相比，模型組和丹參素組大鼠TLR4、NF-κB、Caspase3蛋白表達(dá)明顯上升，SIRT1、Bcl-2蛋白含量下降（P＜0.05）；與模型組相比，丹參素組TLR4、NFκB、Caspase3蛋白表達(dá)明顯下降，SIRT1、Bcl-2蛋白含量表達(dá)比模型組顯著上升（P＜0.05）。（圖5）。

圖5 蛋白表達(dá)水平測(cè)定

3 討論

丹參素是丹參治療冠心病的重要活性成分，具有擴(kuò)張血管，增加冠狀動(dòng)脈血流量，增強(qiáng)組織抗缺氧能力，減輕炎癥反應(yīng)等心肌保護(hù)作用[7]。衛(wèi)國(guó)等[5]建立心肌梗死模型大鼠，給予丹參素治療后，發(fā)現(xiàn)大鼠心功能明顯改善，心肌梗死面積減少，認(rèn)為丹參素可以明顯減輕心肌梗死大鼠的心肌損傷，其機(jī)制可能與丹參素上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1、CXC趨化因子受體4等蛋白表達(dá)從而促進(jìn)缺血心肌的血管新生有關(guān)。本研究結(jié)果表明，光鏡下模型組可見心肌纖維增粗、心肌纖維結(jié)構(gòu)破壞、排列紊亂；大量心肌細(xì)胞變小或變性，心肌間質(zhì)充血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等。研究表明，丹參素可有效改善大鼠心肌梗死，抑制心肌細(xì)胞的凋亡；丹參素組大鼠心肌梗死面積顯著減少，丹參素可顯著減少大鼠心肌梗死面積和心肌細(xì)胞的死亡。同時(shí)，丹參素組大鼠可見心肌纖維增粗、心肌纖維排列相對(duì)整齊，心肌細(xì)胞較少量的變性、心肌組織水腫恢復(fù)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，病變程度逐漸恢復(fù)。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）是一種輔酶Ⅰ依賴性的去乙?；福哂懈叨缺Ｊ匦訹8]，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)DNA修復(fù)、細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等機(jī)體生理病理過(guò)程[9，10]。研究表明，SIRT1是公認(rèn)的抗冠狀動(dòng)脈粥樣硬化因子，其可能通過(guò)抑制ox-LDL表達(dá)來(lái)引導(dǎo)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)內(nèi)皮性NO的表達(dá)和釋放， 其是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵酶，能明顯減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激作用[11]。本研究結(jié)果表明，丹參素可有效提高心肌組織內(nèi)SIRT1表達(dá)，減輕心肌細(xì)胞凋亡及心肌纖維化。SIRT1可調(diào)節(jié)P53、MyoD、FOXO3以及NF-kB來(lái)介導(dǎo)應(yīng)激時(shí)細(xì)胞防御和生存，是一種與細(xì)胞的代謝狀態(tài)密切相關(guān)的重要調(diào)節(jié)器[12]。本研究結(jié)果表明，丹參素促進(jìn)SIRT1表達(dá)后，丹參素組TLR4、NF-κB、Caspase3蛋白表達(dá)明顯下降，SIRT1、Bcl-2蛋白含量表達(dá)比模型組顯著上升，說(shuō)明丹參素是通過(guò)抑制炎癥信號(hào)通路TLR4/NF-κB信號(hào)通路來(lái)改善大鼠心肌梗死，顯著減少大鼠血清中TNF-α和IL-6 等炎癥因子的生成和釋放，抑制心肌組織內(nèi)的免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)，促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖和發(fā)育，顯著改善心肌組織的壞死情況。

綜上所述，丹參素可通過(guò)促進(jìn)SIRT1表達(dá)，抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路來(lái)改善大鼠心肌梗死，抑制心肌纖維化，對(duì)心肌起到營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)的作用改善心功能。本結(jié)果證實(shí)丹參素具有心肌保護(hù)作用，為明確現(xiàn)代中藥新藥的藥理機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。