梁宇鵬，趙江源，楊佩文，何 翔，文孟良，李銘剛

(1.云南大學(xué)云南省微生物研究所，云南 昆明650091；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，云南 昆明 650205)

鐵是地球絕大多數(shù)生命形式主要甚至必需的營(yíng)養(yǎng)元素，參與了微生物包括三羧酸循環(huán)及核酸生物合成等重要生理過程[1-2]。微生物通過鐵載體化合物來攝取環(huán)境中的鐵，并由此帶來多元化的生態(tài)效應(yīng)。已有研究發(fā)現(xiàn)，特定結(jié)構(gòu)類型的鐵載體可促進(jìn)環(huán)境樣本中特定類群微生物的生長(zhǎng)[2-5]，微生物行為學(xué)研究進(jìn)一步揭示了微生物還可通過鐵載體為介導(dǎo)，在群體間產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)、互利、合作或其它相互適應(yīng)性行為[6-7]，對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，并進(jìn)一步影響到土壤的生態(tài)功能。土壤微生物鐵載體化學(xué)多樣性、分布規(guī)律和土壤礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)作用研究表明[8-9]，微生物鐵載體是土壤根際微生物生長(zhǎng)代謝的重要影響因素[10]。這些產(chǎn)鐵載體微生物可對(duì)植物礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收代謝做出重要貢獻(xiàn)[11]，甚至有人提出可以應(yīng)用微生物鐵載體來行使化肥的功能[12]?？傊?，微生物鐵載體在礦物質(zhì)元素釋放和生物地質(zhì)循環(huán)過程中發(fā)揮了不可替代的作用[13-14]。鐵載體化合物及其產(chǎn)生菌在環(huán)境修復(fù)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

微生物群落功能是連接微生物多樣性與相應(yīng)生態(tài)系統(tǒng)的重要橋梁。對(duì)功能微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，可以回答“誰，做了什么？”這一微生物生態(tài)領(lǐng)域問題。擴(kuò)增子高通量測(cè)序可以解答環(huán)境有“誰”存在的問題，宏基因組學(xué)可以解答“做了什么”的問題，但要對(duì)微生物多樣性的特定功能進(jìn)行辨識(shí)，這些方法可提供的信息還不夠[15]。因此，需要建立更多以功能為導(dǎo)向的微生物群落研究方法。本研究以云南省哀牢山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)低海拔河谷森林和高海拔原始森林土壤樣本為研究材料，采用純培養(yǎng)篩選、分離土壤中的產(chǎn)鐵載體微生物，結(jié)合高通量擴(kuò)增子測(cè)序，對(duì)環(huán)境樣本中的功能性可操作分類單元(operational taxonomic units, OTU)進(jìn)行定位，考察功能類群與采樣環(huán)境之間的關(guān)系，分析其內(nèi)在原因，研究結(jié)果可為鐵載體真核微生物資源定向發(fā)掘和群落功能結(jié)構(gòu)研究工作提供參考數(shù)據(jù)和方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 土樣采集

2017年12月，在云南省哀牢山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(東經(jīng)100°49′～101°53′，北緯23°95′～24°17′)內(nèi)，從低海拔河谷灌木林及次生林區(qū)域到高海拔原始森林區(qū)域進(jìn)行采樣，共81個(gè)樣地，采樣海拔500～2 600 m。在不同植被帶設(shè)置坡度、坡向相近的5個(gè)20 m×20 m的樣地(取樣時(shí)記錄采樣環(huán)境地貌及經(jīng)緯度信息)，每個(gè)樣地用直徑2 cm的土壤取樣器以“十”字型分別采集5鉆同一深度土層樣品(采樣深度為10 cm)，混合為1個(gè)土樣后用無菌自封袋裝好并編號(hào)。

1.2 培養(yǎng)基配制

上層培養(yǎng)基為無鐵察氏培養(yǎng)基，其配方為蔗糖30 g，NaNO33 g，K2HPO4·3H2O 1.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂15～20 g，去離子水1 000 mL。

鉻天青S(chrome azurol S，CAS)檢測(cè)液：稱取CAS 60.5 mg，溶解于50 mL去離子水中，加入10 mL Fe3+溶液(1 mmol·L-1FeCl3·6H2O，10 mmol·L-1HCl)，攪拌混勻，記為A液；稱取72.9 mg十六氨基烷基溴化銨溶解于40 mL去離子水中，加熱使其充分溶解，記為B液；將A液與B液緩慢混合搖勻。

CAS下層瓊脂顯色檢測(cè)培養(yǎng)基配制：當(dāng)水瓊脂培養(yǎng)基滅菌后溫度下降到60 ℃時(shí)，按250∶15比例添加CAS檢測(cè)液(0.22 μm濾膜過濾)，充分混勻，并趁熱倒入無菌平皿中，凝固后制備成下層平板備用(呈藍(lán)色)。當(dāng)上層培養(yǎng)基滅菌后溫度下降到60 ℃時(shí)，倒至已制備好的下層平板上，凝固后制備成雙層平板備用。

1.3 產(chǎn)鐵載體功能菌株篩選、分離與鑒定

1.3.1 菌株篩選和分離 將土樣稀釋涂布雙層平板，28～32 ℃下倒置培養(yǎng)5～7 d。鐵載體因螯合CAS-Fe3+-CTAB復(fù)合物中的Fe3+，使復(fù)合物解體而使CAS雙層平板顯現(xiàn)出CAS原有的紅色[16]，因此，可根據(jù)雙層平板顯色圈的顏色和大小來判斷菌株的產(chǎn)鐵載體的能力。

1.3.2 活性菌株的分子鑒定 活性菌株進(jìn)行內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer, ITS)序列測(cè)序(測(cè)序范圍：ITS1～I(xiàn)TS4)。擴(kuò)增引物序列為：ITS1 F 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4 R 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。測(cè)序結(jié)果序列經(jīng)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的BLAST引擎搜索后獲取相關(guān)種屬的ITS序列，用Clustal X 1.8軟件進(jìn)行排列對(duì)齊，排除堿基缺失位點(diǎn)，用鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 代表性土樣的選擇與理化性質(zhì)分析

將活性菌株來源土樣作為后續(xù)分析的代表性土樣。每個(gè)樣點(diǎn)各自另取10 g土樣，烘干后計(jì)算樣品的含水量并記錄。另外稱取10 g土樣，加入25 mL蒸餾水，在150 r·min-1的搖床上充分混勻5 min，靜置30 min后，用pH計(jì)測(cè)定土壤pH值。按照土壤有機(jī)質(zhì)測(cè)定方法[17]進(jìn)行土壤有機(jī)質(zhì)含量測(cè)定，采用原子吸收分光光度法[18]進(jìn)行鐵含量測(cè)定。

1.5 代表性土樣真核微生物DNA提取與生物信息學(xué)分析

1.5.1 高通量測(cè)序DNA的提取與擴(kuò)增 稱取2 g各代表性土樣，采用土壤基因組提取試劑盒MOBIO PowerSoi?DNA Isolation Kit進(jìn)行土壤總DNA提取。高通量測(cè)序(測(cè)序范圍：ITS3～I(xiàn)TS4)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)的引物為：ITS3 F 5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′；ITS4 R 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。擴(kuò)增樣本須經(jīng)質(zhì)量檢查合格后才可測(cè)序，免培養(yǎng)模型每個(gè)樣品預(yù)計(jì)測(cè)序量為10 000條。將模糊堿基、單堿基高重復(fù)區(qū)以及長(zhǎng)度過短的序列去除，得到供精準(zhǔn)分析的優(yōu)化序列，對(duì)序列進(jìn)行去噪，用UPARSE 7.1軟件進(jìn)行聚類分析，以97%的相似性生成OUT。每個(gè)OTU代表1個(gè)物種。

1.5.2 代表性土樣生物信息學(xué)分析 采用RDP classifier貝葉斯算法(http:∥rdp.cme.msu.edu/)對(duì)UNITE ITS數(shù)據(jù)庫(kù)中每個(gè)ITS基因序列進(jìn)行分類分析，分類置信度閾值70%，利用Mothur V.1.30.1軟件進(jìn)行α多樣性分析[19]，采用Shannon、Simpson和Coverage指數(shù)評(píng)估群落多樣性，使用I-Sanger云平臺(tái)(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)進(jìn)行微生物差異與環(huán)境因子相關(guān)性分析，采用Canoco 5軟件進(jìn)行冗余分析。本研究高通量測(cè)序數(shù)據(jù)已上傳到NCBI-SRA(Sequence Read Archive)數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/ PRJNA592046)，登錄號(hào)為：PRJNA592046。

2 結(jié)果與分析

2.1 代表性土壤理化指標(biāo)分析

鐵載體高活性菌株來源于8個(gè)代表土樣，編號(hào)為1_1、1_5、2_5、2_6、2_8、2_14、2_54和2_75，其中，1_1、1_5土樣來源于低海拔河谷灌木林及次生林區(qū)域；其余土樣來源于高海拔原始森林區(qū)域(2_5、2_6、2_8和2_14為常綠闊葉和針葉林；2_54和2_75為常綠闊葉林)。通過分析這些代表性土樣的理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)土壤有機(jī)質(zhì)含量、土壤質(zhì)量含水量、海拔、鐵元素含量和pH值是影響微生物群落結(jié)構(gòu)和分布的重要理化因子，結(jié)果如表1所示。高海拔原始森林(2_5、2_6、2_8、2_14、2_54及2_75)土壤有機(jī)質(zhì)含量和土壤質(zhì)量含水量普遍較高，而土壤pH值和鐵元素含量普遍較低；低海拔河谷灌木林及次生林土樣(1_1及1_5)的理化性質(zhì)則與之相反。

表1 采樣地基本概況

2.2 土壤環(huán)境對(duì)可操作分類單元的總體影響

2.2.1 土壤環(huán)境對(duì)可操作分類單元多樣性的影響 利用高通量測(cè)序技術(shù)，經(jīng)序列過濾去除嵌合體序列，8個(gè)代表性土樣最終得到可用于后續(xù)分析的優(yōu)質(zhì)序列399 042條，質(zhì)控后序列長(zhǎng)度在230～460 bp之間，平均長(zhǎng)度342 bp，滿足序列分析要求。進(jìn)一步采用Qiime軟件，在97%的相似度下將其聚類為可用于物種分類的OTU。8個(gè)樣品共獲得1 550種OUT信息(含7門24綱73目161科316屬)。各樣本測(cè)序深度指數(shù)均大于99.7%，測(cè)序已覆蓋測(cè)試樣品中的大部分物種，可以真實(shí)展示土壤中的絕大多數(shù)真菌。所測(cè)土壤樣本真菌數(shù)量及多樣性分析如表2所示。高海拔原始森林(2_5、2_6、2_8、2_14、2_54及2_75)土壤真菌OUT數(shù)量、群落豐富度和多樣性總體不及低海拔河谷灌木林及次生林區(qū)域土樣(1_1與1_5)，高海拔原始森林土樣的香農(nóng)指數(shù)偏低，而辛普森指數(shù)偏高，這表明高海拔原始森林土壤環(huán)境對(duì)其中生存的微生物存在選擇性影響。

表2 土壤樣本真菌可操作分類單元數(shù)量及多樣性分析

2.2.2 土壤環(huán)境對(duì)可操作分類單元組成的影響 高通量測(cè)序所有OTU數(shù)據(jù)均經(jīng)過抽平后，采用距離算法對(duì)8個(gè)土樣的代表性物種OUT進(jìn)行Average樣本層級(jí)聚類分析[圖1(a)]，發(fā)現(xiàn)來源于低海拔河谷樣本與高海拔原始森林樣本有顯著不同，分別聚于不同的分支。典型相關(guān)分析(canonical correlation analysis, CCA)結(jié)果[圖1(b)]進(jìn)一步表明，環(huán)境因子對(duì)樣本OTU組成有重要影響。土壤鐵含量(ferrous content, FEC)與pH值對(duì)低海拔河谷樣本OTU組成影響較大；而土壤質(zhì)量含水量(soil mass water content, SWC)、土壤有機(jī)質(zhì)含量(soil organic matter content, SOM)和海拔(altitude, ALT)對(duì)高海拔原始森林土樣OTU的組成影響較大。

(a)聚類分析 Clustering analysis (b)典型相關(guān)分析CCA

2.3 土壤環(huán)境對(duì)鐵載體子囊菌功能類群分布的影響

2.3.1 活性菌株與可操作分類單元對(duì)應(yīng)關(guān)系分析 活性菌株-OTU定位聚類圖如圖2所示，所有活性菌株均為子囊菌門微生物。從圖2可以看出，1-1F1、1-5F1和1-5F2分別與ATCC1022、CBS113365及ATCC16903曲霉屬(Aspergillus)典型菌株相似度最高，初步鑒定為曲霉屬微生物。2-75F1與ARSEF2107綠僵菌屬(Metarhizium)典型菌株相似度最高，確定為綠僵菌屬微生物。1-5F3、2-5F1、2-6F1、2-8F1、2-14F1、2-54F1與NRRL2011、NRRL908、CBS223.66、CBS340.48、ATCC18323及CBS117192青霉屬(Penicillum)典型菌株相似度最高，確定為青霉屬微生物。2-8F2與ARSEF3405白僵菌屬(Beauveria)典型菌株相似度最高，確定其為白僵菌屬微生物。2-8F3、2-5F2、2-14F2均與木霉屬(Trichoderma)典型菌株CBS121219相似度最高，為木霉屬微生物。2-6F2與CBS314.59籃狀菌屬(Talaromyces)典型菌株相似度最高，為籃狀菌屬微生物。為分析純培養(yǎng)活性菌株與環(huán)境因子的相互關(guān)系，將鐵載體活性菌株(及其相似標(biāo)準(zhǔn)菌株)的ITS序列與土壤高通量測(cè)序相應(yīng)屬的代表性O(shè)TU序列進(jìn)行聚類分析，從OTU水平對(duì)相應(yīng)的菌株進(jìn)行定位。曲霉屬活性菌株1-1F1、1-5F2與OTU658最為類似，曲霉屬活性菌株1-5F1則與OTU516較為接近[圖2(a)]，綠僵菌屬活性菌株2-75F1可定位為OTU1134[圖2(b)]，青霉屬活性菌株2-6F1、2-14F1、2-8F1、2-5F1可定位為OTU1076，2-54F1及1-5F3可分別定位為OTU1017及OTU475[圖2(c)]。白僵菌屬活性菌株2-8F2與OTU852最接近[圖2(d)]。木霉屬活性菌株2-8F3、2-5F2及2-14F2則可定位為OTU1270[圖2(e)]?；@狀菌屬活性菌株2-6F2與OTU1175較為類似[圖2(f)]。通過該工作，將定位后OTU稱為活性O(shè)TU，所有活性菌株與特定OUT均可以一一對(duì)應(yīng)或多一對(duì)應(yīng)，用于后續(xù)分析。

注：進(jìn)化樹分支上的數(shù)值表示置信度。Note: the value on the branch of the phylogenetic tree represents the confidence.

圖2 活性菌株-可操作分類單元定位聚類圖
Figure 2 Active strains-OTUs location clustering tree

2.3.2 土壤環(huán)境對(duì)活性可操作分類單元分布的影響 依據(jù)2.3.1活性菌株與OTU的定位結(jié)果，對(duì)這些OTU的分布情況進(jìn)行調(diào)查分析，結(jié)果如表3所示。源于曲霉屬的OTU516及OTU658主要集中分布于低海拔河谷灌木林及次生林區(qū)域土樣；源于青霉屬、白僵菌屬、綠僵菌屬、木霉屬及籃狀菌屬的活性O(shè)TU則在所有土樣中均有分布，但源于青霉屬的OTU1017及源于木霉屬的OTU1270絕大部分存在于高海拔原始森林土樣中。

表3 土壤樣品中活性可操作分類單元檢出數(shù)量

活性O(shè)TU分布與環(huán)境因子相關(guān)性分析結(jié)果如表4所示，海拔對(duì)源于曲霉屬的OTU516及OTU658的分布有一定負(fù)影響，而土壤pH值則對(duì)其有正效應(yīng)。土樣有機(jī)質(zhì)含量對(duì)源于青霉屬的OTU1017的分布有極顯著的正影響。同時(shí)，土樣有機(jī)質(zhì)含量對(duì)源于木霉屬的OTU1270的分布也有明顯的促進(jìn)效應(yīng)。

表4 活性可操作分類單元分布與環(huán)境因子相關(guān)性分析

注：***表示P<0.01，顯著相關(guān)；*表示0.05

2.3.3 土壤環(huán)境對(duì)子囊菌功能類群分布的影響 為進(jìn)一步驗(yàn)證2.3.2活性O(shè)TU分布情況的分析結(jié)果，對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果中相關(guān)屬的所有代表性O(shè)TU進(jìn)行了綜合分析，活性菌株相關(guān)屬OTU分布與環(huán)境因子的相關(guān)性分析結(jié)果如表5所示：曲霉屬受pH值(正相關(guān)，P<0.05)、海拔影響較大(負(fù)相關(guān)，P<0.05)，與土壤質(zhì)量含水量有一定負(fù)相關(guān)關(guān)系；青霉屬則與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；另外，白僵菌屬、綠僵菌屬與pH值有一定正相關(guān)關(guān)系(P<0.1)。木霉屬及籃狀菌屬與所有環(huán)境因子的相關(guān)性均不顯著。曲霉屬、青霉屬OTU的總體分析結(jié)果與活性O(shè)TU分析結(jié)果比較吻合。

表5 活性菌株相關(guān)屬可操作分類單元分布與環(huán)境因子的相關(guān)性分析

注：***表示P<0.01，極顯著相關(guān)；* *表示P<0.05，顯著相關(guān)；*表示0.05

3 討論與結(jié)論

土壤環(huán)境對(duì)微生物的組成具有重要的影響。高海拔原始森林土樣與其它土樣相比，土壤有機(jī)質(zhì)含量更高(高海拔原始森林土樣平均為403.87 g·kg-1；低海拔河谷灌木林及次生林土樣平均為50.53 g·kg-1)；而鐵元素含量則更低(高海拔原始森林土樣平均為0.745%；低海拔河谷灌木林及次生林土樣平均為1.09%)。從低海拔河谷灌木林及次生林區(qū)域到高海拔原始森林區(qū)域，土壤質(zhì)量含水量呈增加趨勢(shì)，而土壤pH值則呈下降趨勢(shì)。

結(jié)合土樣中優(yōu)勢(shì)活性O(shè)TU分布情況分析可以看出，有機(jī)質(zhì)含量對(duì)代表青霉屬的OTU1017和木霉屬的OTU1270均有正效應(yīng)，而鐵含量和pH值則為負(fù)效應(yīng)，這可能與微生物活動(dòng)導(dǎo)致的腐殖質(zhì)形成和伴生的鐵元素利用有關(guān)。青霉屬和木霉屬子囊菌都是自然界很重要的纖維降解微生物[20-23]，受高海拔原始森林凋落物(主要成分為纖維素和木質(zhì)素)的長(zhǎng)期馴化，這些微生物對(duì)腐殖質(zhì)的形成產(chǎn)生了重要的影響，而腐殖質(zhì)的增加必定會(huì)提高土層的保水能力；同時(shí)，它們分泌的酸性鐵載體類化合物(真菌的鐵載體絕大部分為異羥肟酸型)也導(dǎo)致了土壤pH值和土壤中鐵元素含量的降低。在這種條件下，森林土壤就會(huì)進(jìn)一步對(duì)其中生存的微生物產(chǎn)生選擇性，比如受pH值正影響的曲霉屬OTU絕大部分源自低海拔河谷灌木林及次生林土樣，并促進(jìn)具有相似功能的微生物形成特定結(jié)構(gòu)的微生物功能群落[24]，因此，高海拔原始森林土壤中真核微生物的多樣性和豐富度要低于低海拔河谷灌木林及次生林土樣。高鐵載體活性菌株獲取鐵元素的能力強(qiáng)，在鐵的爭(zhēng)奪競(jìng)爭(zhēng)中均處于優(yōu)勢(shì)地位，其對(duì)鐵含量的變化不敏感，因此，鐵元素含量與活性O(shè)TU關(guān)系不顯著。

通過純培養(yǎng)結(jié)合ITS擴(kuò)增子高通量測(cè)序的方法，只能間接或部分揭示鐵載體產(chǎn)生菌在環(huán)境中的分布狀態(tài)及其與環(huán)境之間的關(guān)系。受限于純培養(yǎng)條件，圖2展示的許多OTU的功能仍無法確定。如何直觀、全面地反映一個(gè)環(huán)境樣本中鐵載體功能類群的結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境之間的聯(lián)系，還需要設(shè)計(jì)新的考察方法。

特定標(biāo)示基因的篩選是研究產(chǎn)鐵載體真菌群落的基礎(chǔ)，對(duì)于產(chǎn)鐵載體真菌而言，由于絕大多數(shù)物種產(chǎn)異羥肟酸型鐵載體，且涉及鐵載體的合成基因(sidA，sidC及sid2)、調(diào)節(jié)基因(urbs1、sreA、sreP及bir1)及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(mirA及mirC等)都存在一定的保守性[25-26]，在今后的工作中，從這些鐵載體功能基因入手來篩選標(biāo)示基因或許是一種可行的方案。

原始森林土樣中的真核微生物在土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化和土壤礦物質(zhì)利用良性循環(huán)過程中發(fā)揮了重要的作用，其中的產(chǎn)鐵載體真核微生物是一類值得深入挖掘的重要功能性資源。云南有著我國(guó)集中存在的原始森林資源，其在水源涵養(yǎng)、土壤保育及構(gòu)建西南生態(tài)安全屏障方面起到了關(guān)鍵作用[27]，可以預(yù)測(cè)，其中的土壤微生物對(duì)這樣一種生態(tài)系統(tǒng)的形成和維持發(fā)揮了重要作用。通過開展云南原始森林土壤子囊菌功能類群資源發(fā)掘工作，可以充分利用該地區(qū)在地理、氣候及植被上的優(yōu)勢(shì)，獲得多樣性豐富、功能明確的微生物種質(zhì)資源，為持續(xù)深入開展功能微生物的保護(hù)和利用奠定基礎(chǔ)。