王立霞,管夢(mèng)嬌,種道齊,劉世琦

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院,作物生物學(xué)國家重點(diǎn)試驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)試驗(yàn)室,山東 泰安 271018

黃瓜白粉病，又名白毛病，在黃瓜整個(gè)生育期均可發(fā)病，主要危害黃瓜葉片，初期為黃綠色不規(guī)則小斑，后期病斑不斷擴(kuò)大，最終連成一片，嚴(yán)重影響葉片的光合作用，致使植物早衰、嚴(yán)重減產(chǎn)。近年來，隨著種植面積的不斷擴(kuò)大，黃瓜白粉病逐年加劇，嚴(yán)重影響了黃瓜的品質(zhì)及產(chǎn)量。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，多使用化學(xué)方法來防治黃瓜白粉病，而化學(xué)農(nóng)藥的使用不僅使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，而且還增加植物體內(nèi)農(nóng)殘。因此急需尋找一種既能提高抗性又環(huán)保的白粉病防治方法。嫁接作為一門古老的技藝，在繁殖及改良作物品質(zhì)上具有重要作用。前人研究表明，嫁接換根能顯著提高植株抗病性，尤其是土傳病害，如西瓜枯萎病[1,2]、茄子黃萎病[3]、黃瓜枯萎病[4]、黃瓜根結(jié)線蟲病等；也有一些報(bào)道指出嫁接可以提高植株對(duì)葉部病害的抗性，如黃瓜灰霉病、霜霉病、白粉病[5-7]和番茄葉霉病等[8]。隨著嫁接研究的深入，一些新的嫁接技術(shù)也不斷提出[9]，張小平等[10]研究發(fā)現(xiàn)，中間砧嫁接顯著降低甜瓜枯萎病和蔓枯病發(fā)病率；劉強(qiáng)等[11]指出中間砧嫁接能防止西瓜枯萎病，提高耐寒性；任淑年等[12]研究發(fā)現(xiàn)用葫蘆做中間砧既可以避免西瓜自毒問題，又可以提高嫁接西瓜的抗病性；徐小軍等[13]發(fā)現(xiàn)中間砧嫁接可顯著提高嫁接西瓜植株抗枯萎能力。目前雖有一些中間砧嫁接提高植株抗性的試驗(yàn)見諸報(bào)道，但對(duì)黃瓜抗病性，特別是黃瓜白粉病抗性研究較少，因此本試驗(yàn)通過對(duì)黃瓜接種白粉病后一系列的生理生化變化的分析，探討中間砧嫁接處理下黃瓜對(duì)白粉病抗性的影響，以期為中間砧嫁接技術(shù)在黃瓜栽培生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于2016～2017 年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新園進(jìn)行。以‘津優(yōu)35 號(hào)’黃瓜為接穗，市場(chǎng)上常用的三個(gè)甜瓜品種，厚皮甜瓜：‘伊麗莎白’和‘東方脆甜’，薄皮甜瓜：‘景甜F1’為中間砧，‘威盛一號(hào)’南瓜為根砧。試驗(yàn)以常規(guī)嫁接（黃瓜/南瓜）為對(duì)照CK；黃瓜自根苗為T1；中間砧嫁接（黃瓜/伊麗莎白/南瓜、黃瓜/東方脆甜/南瓜、黃瓜/景甜F1/南瓜）為T2、T3、T4，白粉病菌采自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)日光溫室自然發(fā)病植株。

2017 年2 月8 日，南瓜浸種催芽后播種于10×10 cm 的育苗缽中，5 d 后進(jìn)行甜瓜育苗，待南瓜一葉一心時(shí)把甜瓜嫁接到南瓜上（2 月25 日），待甜瓜兩葉一心時(shí)去心，使其莖部加粗，同時(shí)進(jìn)行黃瓜及南瓜催芽、播種，黃瓜子葉展平時(shí)進(jìn)行黃瓜/甜瓜及黃瓜/南瓜嫁接（4 月5 日）。嫁接成活后每隔一天澆一次營養(yǎng)液，5 月1 日，嫁接苗及自根苗兩葉一心時(shí)，取大小一致，長勢(shì)健壯的植株定植到日光溫室中，統(tǒng)一管理，30 d 后接種白粉病，各處理各接種60 株，重復(fù)3 次，每重復(fù)20 株。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

分別于接種白粉病當(dāng)天及接種后10 d 取樣，測(cè)定各物質(zhì)含量。

1.2.1 發(fā)病率和病情指數(shù)的測(cè)定 接種后5 d，10 d，15 d，20 d 后測(cè)定黃瓜植株發(fā)病率和病情指數(shù)，病情指數(shù)按照GB/T 17980.30-2000 進(jìn)行分級(jí)。

1.2.2 細(xì)胞質(zhì)膜透性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的測(cè)定 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的測(cè)定參照王佩芝[14]的方法，硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛含量，蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量，磺基水楊酸法測(cè)定脯氨酸含量[15]。

1.2.3 抗氧化酶和次生代謝相關(guān)酶活性的測(cè)定 分別采用氮藍(lán)四唑法、愈創(chuàng)木酚法、過氧化氫分解法、比色法測(cè)定超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化酶活性，苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活性的測(cè)定采用王學(xué)奎等[16]方法和中國科學(xué)院上海植物生理研究所的方法。

1.2.4 抗性物質(zhì)含量的測(cè)定 木質(zhì)素和纖維素含量的測(cè)定采用紫外分光光度法，總酚含量采用林植芳等[17]方法測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 6.55 軟件（Duncan 新復(fù)極差法）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，Microsoft Excel WPS 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同黃瓜嫁接苗的白粉病抗性比較

由表1 可見，白粉病侵染后，黃瓜嫁接苗較自根苗表現(xiàn)出一定的抗性。接種5 d 后，除T3 處理外，其余處理均發(fā)病，黃瓜自根苗發(fā)病率及病情指數(shù)顯著高于嫁接處理。接種10 d 后，T3 處理有10%發(fā)病，并與其他處理差異極顯著。接種20 d 后，各處理下白粉病發(fā)病率和病情指數(shù)從小到大依次為：T3＜T4＜T2＜CK＜T1。

表1 不同黃瓜嫁接苗的白粉病抗性比較Table 1 Comparison of powdery mildew resistance of different cucumber grafted seedling

2.2 不同嫁接方式對(duì)黃瓜細(xì)胞質(zhì)膜透性的影響

圖1 所示，嫁接不同程度地提高了黃瓜葉片電解質(zhì)滲透率，以自根苗最低，常規(guī)嫁接CK 次之，中間砧嫁接最高。接種白粉病后，自根苗中電解質(zhì)滲透率高達(dá)42%，顯著高于嫁接苗，不同嫁接方式間，以中間砧T3 和T4 處理較低，兩者差異不顯著，但均顯著低于常規(guī)嫁接處理。

丙二醛含量通常用來反應(yīng)細(xì)胞損傷的程度。嫁接后黃瓜葉片中丙二醛含量顯著增加，但不同嫁接處理間差異不顯著，接種白粉病后，葉片中丙二醛含量均有不同程度的升高，常規(guī)嫁接CK、自根苗T1、中間砧T2、T3 和T4 分別升高了41.1%、233.3%、22.6%、12.3%和25.8%，不同嫁接處理下丙二醛含量差異明顯，依次為T1＞CK＞T2＞T4＞T3，說明中間砧嫁接通過降低葉片中質(zhì)膜透性進(jìn)而減輕傷害。

圖1 不同嫁接方式對(duì)黃瓜葉片電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量的影響Fig.1 Effects of different grafting methods on electrolyte permeability and MDA content in cucumber leaves

2.3 不同嫁接方式對(duì)黃瓜滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

圖2 可見，接種白粉病前，黃瓜葉片中可溶性糖含量以中間砧嫁接最高，自根苗次之，常規(guī)嫁接最低，接種白粉病后，黃瓜葉片中可溶性糖含量均有不同程度地提高，以中間砧嫁接含量較高，且三個(gè)中間砧處理中以T3 處理最高。

接種前，黃瓜嫁接苗葉片中脯氨酸含量較自根苗均有明顯提高，不同嫁接處理間以中間砧含量高于常規(guī)嫁接，接種白粉病后，脯氨酸含量顯著增加，各處理增加幅度依次為：T1＞T2＞CK＞T3＞T4，其中脯氨酸含量以中間砧嫁接含量最高，常規(guī)嫁接含量次之，自根苗最低。

圖2 不同嫁接方式對(duì)黃瓜葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Fig.2 Effects of different grafting methods on content of osmotic regulators in cucumber leaves

2.4 不同嫁接方式對(duì)黃瓜葉片抗氧化酶活性的影響

由表2 可見，接種前黃瓜嫁接苗葉片中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、過氧化物酶(Peroxidase,POD)、過氧化氫酶(Catalase from micrococcus lysodeikticus,CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(Aseorbateperoxidase,APX)活性顯著高于自根苗，且以中間砧T3 處理的黃瓜嫁接苗抗氧化酶活性最高。接種白粉病后，SOD、POD、CAT 和APX 活性不同程度增加，且嫁接苗活性顯著高于自根苗活性，不同嫁接處理間SOD 和POD 活性差異不顯著，CAT 和APX 活性則以中間砧高于常規(guī)嫁接。

表2 不同嫁接方式對(duì)黃瓜葉片保護(hù)酶活性的影響Table 2 Effects of different grafting methods on protective enzyme activity in cucumber leaves

2.5 不同嫁接方式對(duì)黃瓜次生代謝相關(guān)酶活性的影響

由表3 可以看出，嫁接顯著提高黃瓜葉片中苯丙氨酸解氨酶(L-phenylalanine ammonia-lyase,PAL)活性，接種白粉病后，黃瓜葉片中PAL 活性呈現(xiàn)不同程度地增加，以嫁接苗高于自根苗，且不同嫁接方式間PAL 活性差異不顯著。接種前，各處理下黃瓜葉片中多酚氧化酶活性(Polyphenol oxidase,PPO)與對(duì)照差異顯著，以中間砧T3 和T4 較高；接種后不同處理間PPO 活性差異明顯，依次為T4、T3＞T2＞CK＞T1。

2.6 不同嫁接方式對(duì)黃瓜抗性物質(zhì)含量的影響

由表3 可知，接種白粉病前，嫁接苗黃瓜葉片中的木質(zhì)素含量顯著高于自根苗，接種白粉病后，木質(zhì)素含量有不同程度的升高，不同嫁接方式間無顯著差異，但均顯著高于自根苗。

接種白粉病前，各嫁接方式處理下黃瓜葉片中總酚含量顯著高于自根苗，接種白粉病后不同嫁接方式下黃瓜葉片中酚類物質(zhì)含量有明顯差異，以中間砧嫁接＞常規(guī)嫁接＞自根苗，接種前后均以T3處理的總酚含量最高，分別較常規(guī)嫁接苗高出10%和6%。

纖維素作為植物細(xì)胞壁的重要組成成分，在維持細(xì)胞形態(tài)和抵御病原微生物方面具有至關(guān)重要的作用。未經(jīng)白粉病侵染的黃瓜嫁接苗纖維素含量顯著高于自根苗，不同嫁接方式間以中間砧嫁接T4 含量最高，常規(guī)嫁接和中間砧品種T2、T3 無顯著差異，接種后葉片中纖維素含量不同程度升高，常規(guī)嫁接及三個(gè)中間砧嫁接苗分別增加了60%、36%、63%、62%，自根苗增加幅度最小，僅為15%。

表3 不同嫁接方式對(duì)黃瓜葉片抗性物質(zhì)及次生代謝相關(guān)酶活性的影響Table 3 Effects of different grafting methods on the activities of resistance substance and secondary metabolism related enzymes in cucumber leaves

3 討論

嫁接作為防治土傳病害、克服保護(hù)地土壤連作障礙、實(shí)現(xiàn)作物抗病增產(chǎn)的最有效措施，被廣泛應(yīng)用于葫蘆科和茄科等蔬菜作物的抗病增產(chǎn)上[18,19]，前人研究表明，嫁接可以提高黃瓜對(duì)疫病和枯萎病的抗性[20]、降低黃瓜綠斑駁花葉病毒病[21]的發(fā)生；降低番茄對(duì)煙草花葉病毒的感病率[22]。孟凡魯?shù)萚9]研究發(fā)現(xiàn)，甜瓜中間砧嫁接能顯著降低西瓜枯萎病發(fā)病率。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中間砧嫁接可提高黃瓜植株對(duì)白粉病的抗性，三個(gè)不同的中間砧品種以‘東方脆甜’的抗性最強(qiáng)。

電解質(zhì)滲透率和MDA 含量可作為反應(yīng)細(xì)胞膜受傷害程度的重要指標(biāo)。趙依杰等[23]研究發(fā)現(xiàn)，西瓜受到病菌侵染后，葉片中MDA 含量明顯增加，且以嫁接苗含量低于自根苗。劉業(yè)霞等[24]研究發(fā)現(xiàn)，辣椒嫁接苗通過積累可溶性糖和脯氨酸來增加對(duì)青枯病的抗性。本研究中黃瓜受到白粉病侵染后，葉片中的可溶性糖、脯氨酸和MDA 含量均有不同程度的增加，其中電解質(zhì)滲透率和MDA 含量以中間砧嫁接苗較低，常規(guī)嫁接次之，自根苗最高，接種白粉病菌前后的可溶性糖和脯氨酸含量均以中間砧嫁接苗含量最高，說明中間砧嫁接可通過較高的糖含量，調(diào)節(jié)細(xì)胞中蔗糖的平衡，促進(jìn)蔗糖轉(zhuǎn)化為能量，增加葉片細(xì)胞壁厚度和對(duì)病原菌的抗性，除此還可通過兩次嫁接積累滲透調(diào)節(jié)等物質(zhì)來維持細(xì)胞膨壓，防止蛋白質(zhì)變性[25]，減輕病菌對(duì)細(xì)胞膜的傷害程度，提高抗性。

PAL 和PPO 作為苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶和氧化酶，可通過調(diào)控植物中酚類物質(zhì)的氧化速率來調(diào)控植物的抗病反應(yīng)[26]。前人研究表明，脅迫條件下，嫁接苗中的防御酶活性[27,28]、次生代謝相關(guān)酶活性[29]、酚類含量[30]、木質(zhì)素含量[31]、纖維素含量均有不同程度的升高，且顯著高于自根苗。本試驗(yàn)中接種白粉病后，黃瓜葉片中抗氧化酶和次生代謝相關(guān)酶活性均有不同程度地升高，不同嫁接方式間除POD、PAL 活性無顯著差異外，其余均以中間砧嫁接高于常規(guī)嫁接，三個(gè)中間砧品種以‘東方脆甜’高于其他兩個(gè)中間砧品種；白粉病侵染后，不同嫁接苗間木質(zhì)素含量差異不大，但均明顯高于自根苗；除此之外，接種白粉病前后，酚類物質(zhì)及纖維素含量均以中間砧嫁接苗明顯高于常規(guī)嫁接苗和自根苗。前人研究發(fā)現(xiàn)，具有消除活性氧傷害的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（POD）以及與抗菌素和木質(zhì)素等增強(qiáng)其抗性的次生代謝產(chǎn)物合成有關(guān)的多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（PAL）的活性與其抗性呈顯著正相關(guān)[32,33]。本試驗(yàn)中，與黃瓜自根苗相比，中間砧嫁接顯著降低了黃瓜白粉病發(fā)病率，在接種白粉病后10 d 內(nèi)，中間砧嫁接的發(fā)病率也不同程度地低于常規(guī)嫁接，說明中間砧嫁接苗通過增加抗氧化酶和次生代謝酶活性來維持較高的自由基清除能力和加速黃瓜的次生代謝，從而形成較多的酚酸類物質(zhì)和木質(zhì)素，加固機(jī)械屏障，增強(qiáng)抵御能力，減輕病菌對(duì)組織細(xì)胞的傷害[34]。嫁接誘導(dǎo)了植株體內(nèi)抗性基因的表達(dá)調(diào)控，增加了相關(guān)基因的合成表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生了更多的與抗性有關(guān)的代謝物質(zhì)，除此之外，嫁接后砧穗合為一體，砧-穗互作、砧木與接穗本身固有的遺傳特性、生理生化抗性、組織結(jié)構(gòu)交織在一起，從而使嫁接植株表現(xiàn)出較強(qiáng)抗性[35]。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)中，中間砧嫁接可通過積累可溶性糖、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，降低葉片中質(zhì)膜透性進(jìn)而減輕傷害；增加抗氧化酶和次生代謝酶活性來維持較高的自由基清除能力和加速黃瓜的次生代謝，從而形成較多的酚酸類物質(zhì)、木質(zhì)素、纖維素等抗性物質(zhì)，提高黃瓜對(duì)白粉病的抗性。其中，三個(gè)中間砧品種以‘東方脆甜’的綜合品質(zhì)較好，為中間砧嫁接的適宜品種。