趙 茜，努日比婭姆·麥麥提托合提，張 博，阿爾曼·海熱，宋玉坤，阿布力孜·吾斯曼*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.成都西囡婦科醫(yī)院，四川成都 610023）

卵丘細胞是包裹在卵母細胞周圍的顆粒細胞群，它與卵母細胞構(gòu)成卵丘-卵母細胞復(fù)合體（COCs）并通過間隙連接調(diào)節(jié)卵母細胞的發(fā)育與成熟[1]。與其他哺乳動物一樣，卵泡刺激素（FSH）、促黃體素（LH）等激素調(diào)控綿羊卵泡的發(fā)育[2]，而激素的作用則依賴于相應(yīng)受體的表達。同時，卵丘細胞擴展依靠相關(guān)基因的參與，以保證卵丘完整、卵丘擴展及卵母細胞成熟的完成。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（BMP15）屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）超家族中的一員，是卵泡發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在卵泡發(fā)育中以自分泌和/或旁分泌因子的作用影響卵母細胞發(fā)育及成熟。有研究表明，BMP15 促進牛顆粒細胞FSH 受體表達及調(diào)控其激素分泌[3]，并且抑制卵丘細胞的凋亡[4]，調(diào)控顆粒細胞的增殖和分化。卵泡發(fā)育過程中，除機體內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)控外，通過顆粒細胞和卵丘細胞介導(dǎo)的卵母細胞自分泌、旁分泌因子同樣維持卵泡發(fā)育內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)卵母細胞成熟[5]。卵母細胞分泌的BMP15 和生長分化因子9（GDF9）參與卵母細胞與卵丘細胞/顆粒細胞的雙向信息交流[6]，且BMP15 在卵母細胞中特異性表達[7]。

在綿羊卵泡發(fā)育中，BMP15 的作用機理研究較少，本實驗以綿羊卵丘細胞為研究對象，利用熒光定量PCR法測定在綿羊卵丘細胞體外培養(yǎng)環(huán)境中添加不同濃度BMP15 對卵丘細胞擴展相關(guān)基因及激素受體基因表達量的影響，探索BMP15 對綿羊卵丘細胞調(diào)控卵泡發(fā)育的影響，為優(yōu)化卵母細胞體外成熟培養(yǎng)條件提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 綿羊卵巢采自新疆烏魯木齊市新華凌某牛羊屠宰場。BMP15（R&D）、DMEM/F12、胰蛋白酶和胎牛血清FBS 購自Gbico 公司，透明質(zhì)酸酶和肝素鈉購于Solarbio 公司，細胞RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自TaKaRa 公司，磷酸緩沖鹽溶液PBS 購自上海生工，其余藥品均購自美國Sigma 公司。

1.2 試劑配制 采卵液：準確稱取9.5 g TCM199，4 g BSA，2.383 g HEPES，0.4 g NaHCO3，6.86 g HEPESNa+，青霉素、鏈霉素各0.1 g 放入滅菌去離子水中溶解，加入30 mL 2 500 U/L 肝素鈉溶液，滅菌去離子水定容至1 000 mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中公布的綿羊β-actin、FSHR、LHR、E2R、HAS2、PTGS2、PTX3基因序列設(shè)計熒光定量引物（表1），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 Real-time PCR 引物信息

1.4 實驗方法

1.4.1 卵巢收集 從屠宰場采集健康綿羊卵巢，放入35～37℃含有0.1% 青霉素和鏈霉素的生理鹽水的保溫瓶中，于2 h 內(nèi)運回實驗室。選擇形態(tài)正常、無黃體的健康卵巢用眼科手術(shù)剪剪去卵巢表面系膜等結(jié)締組織并于生理鹽水中反復(fù)清洗。

1.4.2 卵母細胞采集 本實驗采用割卵法進行卵母細胞的收集。用鑷子固定卵巢，選擇直徑3～8 mm 的卵泡用手術(shù)刀片割破，使卵泡液流入放有采卵液的培養(yǎng)皿中，置于恒溫板上。

1.4.3 卵丘細胞收集及培養(yǎng) 在體視鏡下用撿卵針挑選胞質(zhì)均勻、包裹有三層以上卵丘細胞的COCs，放入0.1%透明質(zhì)酸酶中使用移液槍反復(fù)吹打直至卵丘細胞與卵母細胞完全分離，體視顯微鏡下洗出裸卵。將含有卵丘細胞的混合液收集于1.5 mL 離心管中，加入HEPES緩沖液至1 mL，2 000 r/min 離心5 min，洗滌2 次后用DMEM/F12 培養(yǎng)液離心洗滌1 次。將分離得到的綿羊卵丘細胞重懸于含有10% 的FBS 及0.1% 雙抗的DMEM/F12 培養(yǎng)液中37℃、5% CO2完全濕度培養(yǎng)，待細胞鋪滿80%時傳代。

1.4.4 卵丘細胞消化傳代 棄去舊培養(yǎng)基，用1 mL PBS清洗2 次，加入1 mL 0.25% 胰酶輕微晃動培養(yǎng)瓶，將消化液分布至所有細胞表面，放于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中消化2 min。鏡下觀察細胞間隙增大時加入2 mL 完全培養(yǎng)液終止消化。用移液槍輕輕吹打使細胞脫離并將混合液放入1.5 mL 離心管中2 000 r/min 離心5 min，收集卵丘細胞，加入完全培養(yǎng)基吹打成細胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細胞數(shù)為1×105個/mL，重新接種于培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)皿中細胞鋪滿80% 時分別加入含有不同濃度BMP15（0、25、50、100、200 ng/mL）的低血清（5%FBS）培養(yǎng)液，以0 ng/mL 組為對照，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4.5 細胞RNA 提取 按照TaKaRa miniBEST Universal RNA Extraction kit 提取試劑盒步驟進行RNA 提取，并用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定細胞總RNA 完整性，分光光度計測定總RNA 的濃度和純度（D260/D280=1.8～2.0）。

1.4.6 cDNA 文庫建立 每管按如下體系反轉(zhuǎn)錄：5×RT Buffer 2 μL，RT Enzyme Mix 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，Random 6 mers 5 μL，總RNA1～3 μL，RNase Free dH2O補足至總體積10 μL；在PCR 儀上37℃ 15 min，85℃ 5 s；-20℃保存。

1.4.7 熒光定量PCR 根據(jù)PrimeScript?RT reagent kit（Tli RNaseH Plus）試劑盒，建立25 μL 反應(yīng)體系：熒光染料12.5 μL（終濃度1×），上下游引物各1 μL（終濃度0.4 μmol/mL），cDNA 溶液2 μL（終濃度100 ng/mL），ddH2O 補足體系。目的基因mRNA 水平的表達量變化，以β-actin作為內(nèi)參基因，每樣品cDNA 重復(fù)3 次。

反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃，30 s；變性95℃，5 s，退火53℃，30 s；共37 個循環(huán)；信號采集72℃，1 min終止反應(yīng)。

1.4.8 統(tǒng)計分析 采用2-△△Ct法計算各基因在BMP15作用后的表達量變化。應(yīng)用SPSS19.0 軟件中One-way ANOVA 以及Duncan's 法進行多重比較對各組處理之間基因表達量進行差異性分析，P＜0.05 作為差異顯著的標(biāo)準，P＜0.01 作為差異極顯著的標(biāo)準。

2 結(jié)果

2.1 卵丘細胞總RNA 提取結(jié)果 用試劑盒提取培養(yǎng)卵丘細胞中總RNA，分光光度計測定總RNA 濃度與純度（D260/D280=1.8～2.0），結(jié)果符合要求。經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1，總RNA 有28 s 和18 s 2條帶，表明提取的總RNA 無降解，可以用于后續(xù)實驗。

圖1 卵丘細胞總RNA 凝膠電泳圖

2.2PTX3、FSHR、LHR、E2R、HAS2、PTGS2和β-actin熔解曲線分析 由圖2 可知，目的基因和內(nèi)參基因引物工作狀態(tài)良好，產(chǎn)物峰單一，無非特異性擴增。

圖2 基因熔解曲線圖

2.3 BMP15 對綿羊卵丘顆粒細胞擴展相關(guān)基因mRNA表達量的影響 如圖3 所示，添加50 ng/mL BMP15時HAS2基因表達量顯著高于對照組；添加100 ng/mL BMP15 時HAS2與PTGS2基因表達量極顯著高于對照組及其他濃度處理組，添加100 ng/mL BMP15 時PTX3基因表達量極顯著高于對照組與其他處理組（除50 ng/mL處理組）。

2.4 BMP15 對綿羊卵丘顆粒細胞激素受體基因mRNA表達量的影響 由圖4 可知，添加100 ng/mL BMP15時，F(xiàn)SHR表達量極顯著高于對照組及其他處理組，LHR表達量顯著性高于25、200 ng/mL 濃度組；添加100 ng/mL BMP15 時E2R表達量顯著高于對照組、50、200 ng/mL 處理組，極顯著高于25 ng/mL 處理組。

3 討 論

卵丘細胞擴展是卵母細胞成熟的標(biāo)志之一，卵丘細胞中PTGS2、HAS2和PTX3是卵丘細胞擴展的相關(guān)基因，在LH、FSH 和E2參與下共同完成卵丘細胞的擴展[8]。在卵丘細胞擴展過程中，PTGS2基因主要誘導(dǎo)LH、FSH 等激素與其相應(yīng)的受體結(jié)合[9]，HAS2基因催化透明質(zhì)酸的合成[10]，PTX3基因是排卵相關(guān)基因，敲除小鼠的PTX3基因可以導(dǎo)致小鼠排卵失敗[11]。本研究結(jié)果表明，隨著BMP15 濃度的增加，綿羊卵丘細 胞PTGS2、HAS2和PTX3基因以及FSHR、LHR和E2R的表達量增加，并在100 ng/mL 時表達量達到峰值，濃度進一步增加時表達量降低，說明綿羊卵丘細胞基因表達與BMP15 濃度呈不完全依賴關(guān)系。有研究表明BMP15 可增強小鼠和牛的卵丘擴展[12-14]。翟博[15]添加BMP15 處理培養(yǎng)豬卵丘細胞，利用流式細胞檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)100 ng/mL 添加量可以有效抑制豬卵丘細胞凋亡；Machado 等[16]研究發(fā)現(xiàn)在牛COCs 體外成熟培養(yǎng)液中添加BMP15 可增加PTGS2和PTX3mRNA 水平，這與本研究結(jié)果相似，說明在體外培養(yǎng)卵丘細胞中添加BMP15 可影響PTGS2、HAS2和PTX3基因的表達，可通過添加BMP15 上調(diào)卵丘細胞中PTGS2、HAS2和PTX3基因的表達水平來促進卵丘細胞擴展，進而提高綿羊卵母細胞發(fā)育質(zhì)量。

FSH、LH 是卵泡發(fā)育主要的調(diào)控者[17-18]，F(xiàn)SHR、LHR的獲得對顆粒細胞分化和卵泡成熟是必需的[19]。FSH 刺激未成熟的有腔卵泡，上調(diào)促黃體激素受體的表達水平，并且可促進卵巢分泌少量E2[20]，E2加強FSH 刺激顆粒細胞表達LHR。付瑤等[3]研究發(fā)現(xiàn)添加100 ng/mL BMP15 可以促進牛顆粒細胞FSHR基因表達，這與本研究結(jié)果一致。Ken Shimizu 等[21]在人顆粒細胞培養(yǎng)液中添加BMP15 時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHR基因表達量隨著BMP15濃度的增加而升高，呈劑量依賴關(guān)系，這與本研究結(jié)果不一致，可能由于人和綿羊卵丘細胞對于BMP15 敏感性不同而導(dǎo)致。

圖3 HAS2、PTGS2、PTX3 mRNA 相對表達量

圖4 FSHR、E2R、LHR mRNA 相對表達量

4 結(jié) 論

本實驗條件下，添加BMP15 可以提高體外培養(yǎng)卵丘細胞擴展相關(guān)基因HAS2、PTGS2、PTX3基因和激素受體FSHR、E2R、LHR基因的表達，并且在100 ng/mL濃度時表達量最高，但隨著BMP15 濃度增加，各基因表達量開始下降。推測添加BMP15 不僅能夠促進綿羊卵丘細胞FSHR、E2R、LHR的表達，還能夠調(diào)節(jié)其激素分泌。