朱翔杰, 徐新建, 周姝婧, 郝振幫, 陳 琳, 周冰峰

(福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院), 福州 350002)

研究昆蟲胚胎發(fā)育過程，有助于理解幼蟲器官起源和發(fā)生過程，以及成蟲生理和組織結(jié)構(gòu)(Campos-Ortega and Hartenstein, 1986; 彩萬志等, 2011)。中華蜜蜂Apisceranacerana是我國寶貴的本土蜂種資源，作為重要的授粉昆蟲，在維護生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用(Burkleetal., 2013; Stanleyetal., 2017)。蜜蜂也是發(fā)育狹溫性社會昆蟲的典型代表，與廣溫性昆蟲相比，蜜蜂胚胎的發(fā)育速率穩(wěn)定，是研究胚胎發(fā)育的理想素材。蜜蜂胚胎是在穩(wěn)定的理想溫度條件下完成發(fā)育的(Seeley and Heinrich, 1981; Kronenberg and Heller, 1982; Stabentheineretal., 2010; 蘇榮茂等, 2014)，蜂巢的中心最為穩(wěn)定，可維持在蜜蜂胚胎最佳發(fā)育溫度35℃(Heinrich, 1993; 周冰峰, 2002; Kleinhenzetal., 2003; 周莉等, 2015)。在35℃條件下，中華蜜蜂完成胚胎發(fā)育所需的時間也是非常精確的，平均為69.8 h(江天寶, 2004; 陳琳等, 2017)。

蜜蜂胚胎發(fā)育研究起步較早，自19世紀(jì)后半葉以來就開展了形態(tài)學(xué)研究(Nelson, 1915; Lee, 1958; Fyg, 1959)。蜜蜂胚胎屬于長胚帶胚胎。1915年 Nelson(1915)出版了專著《The Embryology of the Honey Bee》，通過顯微鏡觀察蜜蜂卵的石蠟切片，用手繪圖全面系統(tǒng)地展示了西方蜜蜂A.mellifera胚胎發(fā)育過程，將蜜蜂胚胎發(fā)育劃分出卵裂期、胚盤形成期、胚帶和胚層形成期、器官系統(tǒng)形成期，并記錄了各階段的組織或器官的形成過程。Schnetter (1934) 對胚胎早期的發(fā)育進行了擴展研究。上皮細胞的運動在昆蟲早期胚胎形態(tài)發(fā)生中起著重要的作用，隨著電鏡掃描技術(shù)的應(yīng)用，F(xiàn)leig和Sander(1986, 1988)觀察了蜜蜂胚胎表面的形態(tài)變化和細胞運動。采用冷凍切片進行碘化丙啶染色的方法，通過觀察東方蜜蜂胚胎不同階段的縱切圖，觀察了細胞的分布變化(Huetal., 2019a)。

蜜蜂雌雄胚胎染色體倍型不同。正常情況下，雌性胚胎是由受精后的二倍體卵發(fā)育，雄性胚胎由未受精的單倍體卵發(fā)育。蜂王將受精卵產(chǎn)在較小的六角形工蜂巢房和圓柱形王臺中，將未受精卵產(chǎn)在較大的六角形雄蜂巢房中。雌性胚胎在完成發(fā)育后，在胚后發(fā)育中由于食物和發(fā)育空間不同分化成蜂王和工蜂(周冰峰, 2002)。雄性胚胎在胚后發(fā)育中成為雄蜂。蜜蜂雌雄胚胎在發(fā)育期有所不同，雄性蜜蜂胚胎發(fā)育期略長。

蜜蜂胚胎發(fā)育規(guī)律是研究蜜蜂生物學(xué)的基礎(chǔ)和養(yǎng)蜂技術(shù)研發(fā)的理論基礎(chǔ)。前人對蜜蜂胚胎的研究多集中在西方蜜蜂。由于蜜蜂胚胎非常脆弱，特別是胚胎早期，石蠟切片技術(shù)容易導(dǎo)致胚胎變形破裂(胡小芬等, 2016)，因此文獻中很少見到蜜蜂胚胎的切片照片，大部分是手繪圖。中華蜜蜂胚胎發(fā)育過程中細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及組織器官的發(fā)育過程仍需探索。本研究對中華蜜蜂胚胎發(fā)育過程形態(tài)變化開展連續(xù)觀察，有助于對蜜蜂胚胎發(fā)育的機理以及與胚胎發(fā)育相關(guān)的蜜蜂生態(tài)學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、營養(yǎng)學(xué)等課題開展深入研究。

1 材料與方法

1.1 樣本準(zhǔn)備

中華蜜蜂A.c.cerana蜂群來自福建省福州市(119.23°E, 26.10°N)。在正常蜂群工蜂巢房中采集蜜蜂雌性卵的樣本。蜂群中蜜蜂雌性卵分布在工蜂巢房和王臺中，分別發(fā)育成工蜂和蜂王。工蜂巢房中的卵數(shù)量多，較容易獲取。用蜂王產(chǎn)卵控制器將蜂王限制在有空的工蜂巢房的巢脾上產(chǎn)卵1 h，獲取受精的雌性蜜蜂卵。將工蜂巢房中有雌性卵的巢脾割下，放入恒溫恒濕箱中(CTHI-250型，施都凱儀器設(shè)備上海有限公司)培育。恒溫恒濕箱的溫濕度使用電子溫濕度計每小時自動記錄，樣本卵發(fā)育的位置嚴(yán)格控制在35±0.2℃、相對濕度75%±5%。把限王產(chǎn)卵1 h獲得的蜜蜂卵作為0 h最初始的胚胎，此時的胚胎只有一個卵核，沒有開始發(fā)育。此后每隔4 h取樣一次，共選取18個時間點的蜜蜂胚胎進行石蠟切片和形態(tài)觀察。

1.2 切片和觀察

將蜜蜂卵用5%福爾馬林和2%冰醋酸的Bouin固定液固定并保存(陳佛癡, 1980; 路健和王伶, 2001; 楊捷頻, 2006)。經(jīng)清洗、脫水、透明、透蠟、切片(切片厚度為3 μm，YD-202型切片機，浙江省金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠)、烤片、HE染色(張玉英, 2007; 侯春春和徐水, 2009; 毛曉霞, 2013)。

胚胎切片用B203型生物顯微鏡和TSView7圖像采集器(重慶奧特光學(xué)儀器有限公司)拍照，在顯微鏡下和電腦顯示器上觀察。

2 結(jié)果

2.1 胚胎卵裂期

雌性中華蜜蜂胚胎卵裂期為0-12 h，該階段存在3個明顯的形態(tài)變化：(1)卵核在初始位置開始核裂；(2)核裂產(chǎn)生的卵裂核向卵表層移動，同時仍在核裂；(3)卵裂核到達卵表層繼續(xù)核裂。

剛產(chǎn)下的蜜蜂胚胎卵核位于靠近卵孔一側(cè)約1/4處(圖1: A)。卵裂開始后，卵裂核會與一部分原生質(zhì)構(gòu)成星芒狀(stellate-shaped)的活質(zhì)體(energid)，活質(zhì)體繼續(xù)不斷分裂(圖1: B, C)。當(dāng)卵發(fā)育4 h，觀察到整個胚胎已形成16個活質(zhì)體，說明此時卵核已經(jīng)分裂4次。此時活質(zhì)體位于卵核初始位置周圍(圖1: B)。發(fā)育8 h，活質(zhì)體已移動到胚胎表面，數(shù)量也有所增加。因此4-8 h，活質(zhì)體逐漸向卵的表層移動，根據(jù)活質(zhì)體數(shù)量仍在增多，判斷活質(zhì)體仍在不斷分裂。到達胚胎表面的原生質(zhì)在靠近卵黃一側(cè)仍呈星芒狀(圖1: D)。胚胎表面的活質(zhì)體繼續(xù)分裂，到12 h整個胚胎的表面呈現(xiàn)雙層排列的活質(zhì)體層，星芒狀突起全部消失，呈球形(圖1: E)，卵裂期結(jié)束。

圖1 雌性中華蜜蜂胚胎卵裂期切片圖Fig. 1 Micrographs of embryos of female Apis cerana cerana at the cleavage stageA: 0 h胚胎縱切圖，箭頭顯示卵核Sagittal section of the embryo at 0 h, the arrow indicating the egg nuclei; B: 4 h胚胎縱切圖，箭頭顯示活質(zhì)體Sagittal section of the embryo at 4 h, the arrow indicating the energids; C: 星芒狀活質(zhì)體Stellate-shaped energids; D: 8 h胚胎縱切圖，活質(zhì)體已移動到胚胎表面Sagittal section of the embryo at 8 h, the energids having moved to the surface of the embryo; E: 12 h胚胎縱切圖，可見雙層排列不規(guī)則的活質(zhì)體層Sagittal section of the embryo at 12 h, the energid appearing in an irregular double-layer arrangement. EN: 卵核Egg nuclei; En: 活質(zhì)體Energid; Pl: 原生質(zhì)Plasma.

2.2 胚胎胚盤形成期

雌性中華蜜蜂胚盤形成期為12-28 h。此階段存在2個形態(tài)上的變化：(1)雙層活質(zhì)體層變成單層；(2)活質(zhì)體外面出現(xiàn)細胞膜，形成細胞。

胚胎12 h，表面的活質(zhì)體層為雙層(圖1: E)，胚胎16 h表面活質(zhì)體由雙層向單層變化，內(nèi)層活質(zhì)體向外移動，內(nèi)層活質(zhì)體數(shù)量明顯變少(圖2: A)，在20 h變?yōu)閱螌?圖2: B)。發(fā)育至24 h，活質(zhì)體拉長，原生質(zhì)分為兩個部分：靠近卵表面包圍卵核的一部分原生質(zhì)；靠近卵內(nèi)部的剩余一部分原生質(zhì)?？拷驯砻姘鼑押说囊徊糠衷|(zhì)相互分離(圖2: C)，靠近卵內(nèi)部的原生質(zhì)將融合，最終消失。發(fā)育至28 h，細胞膜完全包圍卵核周圍的原生質(zhì)，成為完整的細胞。整個胚胎表面形成單層細胞結(jié)構(gòu)，即胚盤(圖2: D)。

圖2 雌性中華蜜蜂胚胎胚盤形成期切片圖Fig. 2 Micrographs of the parafin section of embryos of female Apis cerana cerana at the blastoderm formation stageA: 16 h胚胎，胚胎表面活質(zhì)體由雙層向單層的變化中Embryo at 16 h, the energid in the embryonic inner layer moving to the outer layer; B: 20 h胚胎，活質(zhì)體呈現(xiàn)單層結(jié)構(gòu)Embryo at 20 h, the energid appearing in a single layer arrangement; C: 24 h胚胎，活質(zhì)體拉長，使原生質(zhì)分為兩個部分：靠近卵表面包圍卵核的原生質(zhì)和靠近卵內(nèi)部的原生質(zhì)Embryo at 24 h, the energid being elongated to make the plasma divided into two parts: the protoplast surrounding the egg nucleus and near the egg interior； D: 28 h胚胎，胚胎表面形成單層細胞層，胚胎內(nèi)部充斥卵黃Embryo at 28 h, the monolayer cells formed on the surface of embryo, and the interior of embryo being full of yolk.

2.3 胚層形成期

雌性中華蜜蜂胚層形成的時間在32-40 h。此階段存在3個形態(tài)變化：(1)胚胎兩個側(cè)面的細胞向腹面移動，愈合形成外胚層;(2)胚胎腹面細胞被兩側(cè)面細胞包裹，形成中胚層；(3)胚胎背面的胚盤細胞變薄且范圍變大(圖3)。

圖3 雌性中華蜜蜂胚胎胚層形成過程切片圖Fig. 3 Micrographs of the parafin section of embryos of female Apis cerana cerana at the germinal layer stageA: 32 h胚胎橫切圖，腹中線兩側(cè)各出現(xiàn)一條溝痕，將胚盤分為中板和兩個側(cè)板Transverse section of the embryo at 32 h, a groove mark appearing on both sides of the ventral midline, and the blastoderm being divided into the middle plate and two lateral plates; B: 36 h胚胎橫切圖，側(cè)板沿中板外側(cè)向腹中線移動Transverse section of the embryo at 36 h, lateral plates moving to the ventral midline going along with the outer layer of the middle plate; C: 40 h胚胎中部橫切圖，側(cè)板覆蓋中板在腹中線愈合Transverse section in the middle of the embryo at 40 h, lateral plates covering the middle plate, and then coalescing into the ventral midline; D: 32 h胚胎頭部橫切圖Transverse section through the head of the embryo at 32 h. DS: 背帶Dorsal strip (of blastoderm); Ec: 外胚層Ectoderm; LP: 側(cè)板Lateral plate; Me: 中胚層Mesoderm; MP: 中板Middle plate.

在32 h，位于靠近卵孔一側(cè)約1/4處，卵核初始位置附近的細胞最先開始分化，在腹中線兩側(cè)各形成一條溝痕，將胚盤分成中板和兩個側(cè)板(圖3: A)。隨后兩個側(cè)板會沿著中板外側(cè)向腹中線延伸(圖3: B)。在40 h，中板被兩個側(cè)板包進胚胎內(nèi)部，形成中胚層；兩個側(cè)板愈合，形成外胚層(圖3: C)。胚層完全形成，中胚層大約有胚胎的2/3長度，位于胚胎的中部腹面，并由外胚層包裹；在胚胎的頭部和尾部，腹面僅有一層較厚的外胚層細胞(圖3: D)。

2.4 器官和系統(tǒng)形成期

雌性中華蜜蜂胚胎器官和系統(tǒng)形成的時間在40 h以后。器官和系統(tǒng)出現(xiàn)的先后順序為消化系統(tǒng)、馬氏管、絲腺和絲腺管、神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)。

2.4.1消化系統(tǒng)形成：蜜蜂胚胎發(fā)育到44 h，頭部出現(xiàn)口道內(nèi)陷(圖4: A)，到52 h口道形成(圖4: B)；在52 h尾部出現(xiàn)肛道內(nèi)陷(圖4: C)，到56 h肛道形成(圖4: D)。在52 h口道的末端已經(jīng)出現(xiàn)部分中腸；在56 h肛道的末端也出現(xiàn)部分中腸，在胚胎兩端形成的中腸先后向胚胎中部發(fā)育；在60 h中腸形成。 中腸與前腸相連的位置有賁門瓣相隔(圖5)。

2.4.2馬氏管形成：胚胎發(fā)育至48 h，尾部的細胞團背側(cè)出現(xiàn)內(nèi)陷形成馬氏管(圖6: A)，馬氏管迅速的向頭部生長，到56 h已經(jīng)延伸到胚胎的中部(圖6: B)，延伸到胚胎第5個神經(jīng)節(jié)后停止向頭部延伸，繼續(xù)生長變得彎曲折疊。馬氏管根部與中腸和后腸連接處相連(圖6: C)。中華蜜蜂胚胎的馬氏管共有4根。

圖4 雌性中華蜜蜂胚胎口道和肛道形成過程Fig. 4 Formation of embryonic oral and anal canals in female Apis cerana cerana A: 44 h胚胎頭部表面The head surface of the embryo at 44 h; B: 52 h胚胎頭部The head of the embryo at 52 h; C: 52 h胚胎尾部The posterior end of the embryo at 52 h; D: 56 h胚胎尾部The posterior end of the embryo at 56 h.

圖5 雌性中華蜜蜂68 h胚胎縱切圖Fig. 5 Sagittal section of embryo of femaleApis cerana cerana at 68 hBr: 腦 Brain; CV: 賁門瓣Cardiac valve; Mi: 中腸Midgut; Pt: 肛道Proctodaeum.

2.4.3絲腺和絲腺管形成：蜜蜂胚胎的絲腺在48-60 h之間形成，兩根，位于中腸下部、腹神經(jīng)索兩側(cè)(圖7: A)，呈管狀(圖7: B)；在60-64 h，頭部神經(jīng)節(jié)下兩根絲腺向腹中線匯合，閉合形成絲腺管(圖7: C)。絲腺管會向頭前端延伸，在胚胎的下唇后部結(jié)束。

2.4.4神經(jīng)系統(tǒng)形成：蜜蜂胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)包括腦和腹神經(jīng)索。腦分為左腦和右腦，位于胚胎頭部左右對稱。在52 h蜜蜂胚胎頭部兩側(cè)腦的位置已經(jīng)形成了細胞團(圖4: B)，在64 h蜜蜂胚胎的腦形成(圖7: C)。在60 h時神經(jīng)節(jié)形成。蜜蜂胚胎的腹神經(jīng)索共有14個神經(jīng)節(jié)，其中12個位于胚胎中腸腹面，另外2個分別位于頭部和后腸腹面(圖8: A)。與其他神經(jīng)節(jié)相比，蜜蜂胚胎頭部的神經(jīng)節(jié)非常大，沿著食管兩側(cè)伸向背面與蜜蜂左右腦相連(圖7: C)。單個的神經(jīng)節(jié)由兩團呈現(xiàn)梭形的神經(jīng)細胞群構(gòu)成，這兩團細胞在神經(jīng)節(jié)的中部相連，使得神經(jīng)節(jié)形如“H”(圖8: B, C, D)。

圖6 雌性中華蜜蜂胚胎馬氏管的形成Fig. 6 Formation of the Malpighian tubules of female Apis cerana cerana during embryogenesisA: 48 h胚胎尾部，箭頭所指馬氏管發(fā)育初期的內(nèi)陷The end part of embryo at 48 h, the arrows indicating the imaginations at the initial development stage of the Malpighian tubules; B: 56 h胚胎中部, 箭頭指馬氏管The middle part of embryo at 56 h, the arrows indicating the Malpighian tubules; C: 68 h胚胎中腸末端, 箭頭指馬氏管The distal mid-intestine of embryo at 68 h, the arrows indicating the Malpighian tubules.

圖8 雌性中華蜜蜂胚胎神經(jīng)系統(tǒng)的形成Fig. 8 Formation of the nervous system of female Apis cerana cerana during embryogenesisA: 60 h胚胎縱切圖Sagittal section of the embryo at 60 h; B: 神經(jīng)節(jié)中部橫切圖Transverse section of a ganglion central part; C: 神經(jīng)節(jié)3/4處橫切圖Transverse section of three-fourths of the ganglion; D: 神經(jīng)節(jié)之間橫切圖Transverse section between ganglions. Br: 腦Brain; Ga: 神經(jīng)節(jié)Ganglion; Mi: 中腸Midgut; NCv: 腹神經(jīng)索Ventral nerve cord; SG: 絲腺Silk gland; St: 口道Stomadeum; TT: 主氣管Tracheal trunk.

圖9 雌性中華蜜蜂胚胎呼吸系統(tǒng)的形成Fig. 9 Formation of the respiratory system of female Apis cerana cerana during embryogenesisA: 56 h胚胎橫切圖Transverse section of the embryo at 56 h; B: 64 h胚胎橫切圖Transverse section of the embryo at 64 h; C: 60 h胚胎橫切圖Transverse section of the embryo at 60 h; D: 68 h胚胎橫切圖Transverse section of the embryo at 68 h; E: 60 h胚胎縱切圖Sagittal sections of the embryo at 60 h. Ga: 神經(jīng)節(jié)Ganglion; Mi: 中腸Midgut; SB: 氣門分支Spiracle branch; TBv: 腹側(cè)支氣管Ventral tracheal branch; TI: 氣管內(nèi)陷Tracheal invagination; TT: 主氣管Tracheal trunk.

2.4.5呼吸系統(tǒng)形成：呼吸系統(tǒng)由軀體左右兩側(cè)兩根主氣管、前氣管環(huán)、后氣管環(huán)、氣門、氣門與主氣管相連的支氣管以及通過腹神經(jīng)節(jié)腹側(cè)連接左右兩根主氣管的10根腹側(cè)支氣管組成。在56 h已經(jīng)出現(xiàn)氣管內(nèi)陷，并且氣管的內(nèi)陷向腹側(cè)形成支氣管(圖9: A)，兩個氣門之間的主氣管形成一部分，還未相連；在60 h腹側(cè)支氣管形成；在64 h氣管內(nèi)陷的開口縮小形成氣門(圖9: B)，前后氣管環(huán)形成，氣管系統(tǒng)形成。

中華蜜蜂的腹側(cè)支氣管通過神經(jīng)節(jié)的腹面與兩根主氣管相連(圖9: C, D, E)，前氣管環(huán)位于腦和背血管開口之間并與兩根主氣管相連，后氣管環(huán)位于后腸腹面，并與兩根主氣管相連。

2.4.6背血管形成：中華蜜蜂胚胎的背血管形成較晚，在60 h胚胎兩側(cè)的成心肌細胞還未在背中線匯合。在64 h可以觀察到背血管形成(圖10)。背血管的內(nèi)徑大于馬氏管和氣管，開口位于頭胸相連的位置，前氣管環(huán)后部。結(jié)束于胚胎最后一個體節(jié)和前一體節(jié)相連接的位置。在胚胎的尾部，背血管的內(nèi)徑隨著體節(jié)的變小而變小。

圖10 雌性中華蜜蜂64 h胚胎橫切圖Fig. 10 Transverse section of female Apis cerana cerana embryo at 64 hDV: 背血管Dorsal vessel; Mi: 中腸Midgut.

3 討論

胚胎學(xué)是研究發(fā)育、行為、進化的基礎(chǔ)(Twyman, 2006)。本研究通過石蠟切片技術(shù)的摸索，成功獲得了我國特有蜂種中華蜜蜂胚胎的切片圖。根據(jù)中華蜜蜂胚胎發(fā)育特征與時間的關(guān)系，參考其他全變態(tài)昆蟲(Gaunt and Miles, 2002; 原建強等, 2008; Yue and Hua, 2010)和前人對西方蜜蜂的研究(Nelson, 1915; Fleig and Sander, 1985, 1986)，提出了中華蜜蜂胚胎發(fā)育的階段劃分，各階段的特征以及對應(yīng)的具體時間。蜜蜂作為研究胚胎發(fā)育的特色之一，體現(xiàn)在發(fā)育速率的穩(wěn)定性，因此，明確每個發(fā)育階段的準(zhǔn)確時間成為可能，這是蜜蜂胚胎發(fā)育研究的特色內(nèi)容。研究結(jié)果有助于更好地理解、認(rèn)識和掌握蜜蜂胚胎發(fā)育的整個過程。

卵裂階段應(yīng)以卵裂開始為起點和卵裂結(jié)束為該階段的終點，中華蜜蜂卵裂階段在12 h結(jié)束，卵裂速度快于西方蜜蜂。有研究西方蜜蜂胚胎產(chǎn)下2 h為合子形成期(Huetal., 2019b)。文獻記載東方蜜蜂胚胎卵裂時間略有不同，Hu等(2019a)觀察在4 h時還幾乎沒有卵裂。本研究發(fā)現(xiàn)剛產(chǎn)下的蜜蜂二倍體胚胎卵核未發(fā)生卵裂，但發(fā)育至4 h根據(jù)卵裂核數(shù)量為16個判斷卵裂已發(fā)生了4次。由此推測東方蜜蜂卵裂在卵產(chǎn)下后受精形成合子后開始，也就是卵產(chǎn)下2-4 h。隨后這些卵裂核向卵的表面移動，根據(jù)本研究中華蜜蜂卵裂核在6 h到達卵表面，在發(fā)育12 h時，活質(zhì)體數(shù)量不再明顯增加，呈現(xiàn)雙層排列的活質(zhì)體層，因此認(rèn)為中華蜜蜂在此時卵裂結(jié)束。西方蜜蜂卵裂核到達卵表面的時間Nelson(1915)認(rèn)為是在8-10 h，而Fleig和Sander(1985)用掃描電鏡研究認(rèn)為是7 h，完成卵裂則需要14～16 h(Nelson, 1915)，兩者在卵裂核到達卵表面的時間存在差異可能是樣本精度不同產(chǎn)生的，更精確的時間未知，但均長于中華蜜蜂，說明中華蜜蜂卵裂速度更快。

胚盤形成的特征為卵表面單層細胞結(jié)構(gòu)的形成，有研究表明中華蜜蜂在胚胎發(fā)育至28 h時該單層細胞結(jié)構(gòu)形成，因此，中華蜜蜂胚盤形成期應(yīng)為12-28 h，歷時16 h。西方蜜蜂胚盤形成期歷時14-16 h(Nelson, 1915)，也有人研究在29 h細胞膜還未形成，提出在33 h胚盤完全形成(Fleig and Sander, 1986)，但通過文獻中圖片觀察，此時靠近頭部的胚層已經(jīng)形成明顯的凹陷，表明胚層已經(jīng)分化，因此判斷西方蜜蜂胚盤形成應(yīng)在29-33 h之間完成，慢于東方蜜蜂。

蜜蜂中胚層與外胚層形成過程與許多昆蟲有差異。大多數(shù)昆蟲胚層形成過程中，中板細胞內(nèi)陷形成一條小管，然后小管分層變?yōu)閱螌拥闹信邔?，如果蠅和甜菜夜蛾Spodopteraexigua(崔峰等, 2004)。蜜蜂胚層形成過程中，沒觀察到小管的結(jié)構(gòu)，中板向胚胎內(nèi)部移動過程中，中板與側(cè)板完全分離，側(cè)板沿著中板表面相向延伸覆蓋中板形成外胚層(圖3: A, B, C)。

器官系統(tǒng)形成期為40 h直至孵化，是蜜蜂內(nèi)部器官的形成階段。前人將該階段以卵表面形態(tài)變化為依據(jù)細分出胚帶形成期和幼蟲軀體形成期2個階段(Fleig and Sander, 1986)。在對中華蜜蜂胚胎切片的觀察發(fā)現(xiàn)，即使卵表面觀察到蜜蜂胚胎在背合，而此時背血管仍未形成，在64 h可以觀察到完整的背血管(圖10)。馬氏管、中腸、后腸和氣孔等器官在64 h后仍然在發(fā)育精致化。因此，我們認(rèn)為40 h至胚胎發(fā)育完成的過程不宜分割，該階段為蜜蜂器官系統(tǒng)形成的一個完整過程。

致謝福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院張翠平、葉善斌、安木曼、陸啟皇、付凡、鄔童童、楊冉等參與部分實驗，在此表示感謝！