董松果,李浩,李東方,張勝利

（1.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003；2.河南省糧食作物基因組編輯工程技術(shù)中心,河南新鄉(xiāng)453003；3.現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南新鄉(xiāng)453003）

小麥籽粒中的粗蛋白含量是小麥品質(zhì)類型劃分的重要依據(jù)之一,小麥品質(zhì)的優(yōu)劣在很大程度上影響其經(jīng)濟價值[1].小麥種子的蛋白質(zhì)約85%～90%是儲藏蛋白,主要分布于胚乳中.小麥面粉主要來自于小麥種子的胚乳,其蛋白質(zhì)含量是小麥營養(yǎng)品質(zhì)和加工品質(zhì)的重要指標之一[2].目前,小麥蛋白含量測定有化學(xué)法和物理法,前者大多用常規(guī)的消煮+凱氏定氮法或者消煮+連續(xù)流動分析儀法[3-4],這些方法都具有較高的準確度,但是需要對試驗材料進行消煮等繁雜的化學(xué)處理,比較耗時費力,同時試驗中強酸、強堿的使用會造成一定的環(huán)境污染；后者常用的是近紅外光譜法[5].作為一種無損、快速、高效的現(xiàn)代分析技術(shù),近紅外光譜技術(shù)（near infrared spectrum,NIRS）綜合運用了光譜、計算機和化學(xué)計量學(xué)等多個學(xué)科的最新研究成果,在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)療健康等多個領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應(yīng)用[6-9].美國谷物化學(xué)協(xié)會最早將近紅外光譜技術(shù)應(yīng)用在小麥品質(zhì)檢測中,用來測定小麥蛋白質(zhì)含量和水分含量.隨著光譜技術(shù)、計算機技術(shù)等的進步,近紅外光譜檢測技術(shù)也在不斷發(fā)展,檢測準確度和精度不斷提高.瑞典波通公司生產(chǎn)的DA7250 型近紅外測定儀是該公司推出的第三代二極管陣列近紅外分析儀, 在前兩代基礎(chǔ)上進一步完善了相關(guān)軟硬件,具有更快、更準、更穩(wěn)定的特點.DA7250 采用固定全息光柵分光,銦鎵砷二極管陣列技術(shù),連續(xù)光柵光譜檢測,并行處理所有波長信息,可檢測水分、蛋白、脂肪、淀粉、纖維、灰分、氨基酸等參數(shù).隨著人們生活水平地不斷提高,生產(chǎn)上對優(yōu)質(zhì)強筋小麥的需求日益增加.這對當前小麥生產(chǎn)上優(yōu)質(zhì)強筋品種的快速培育提出了更高的要求.

本研究以33 個小麥品種為材料,進行不同小麥品種蛋白質(zhì)含量的常規(guī)化學(xué)測定方法和近紅外光譜快速測定方法的比較分析,以期為小麥新品種培育中品質(zhì)分析方法選擇提供一定參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 小麥品種共計33 個（西農(nóng)979、豐德存麥1 號、新麥26、陜253、小偃22、鄭麥379、高優(yōu)503、魯麥21、山農(nóng)12 號、濟麥21 號、川麥36、小偃54、京冬22、中優(yōu)9507、煙農(nóng)15、溫麥6 號、豫麥34、矮抗58、洛麥23、偃展4110、綿麥48、濟麥22 號、石家莊8 號、新麥9 號、揚麥16、濟麥19 號、皖麥19、京411、揚麥158、京冬8、漯麥18、輪選66、新麥35）,其中優(yōu)質(zhì)強筋小麥品種17 個,中筋品種16 個.試驗材料種植于河南、陜西兩個生態(tài)點,其中河南為兩年數(shù)據(jù).

1.1.2 儀器試劑 近紅外測定儀為瑞典波通公司生產(chǎn)的DA7250 型；磨粉機為杭州大成光電公司生產(chǎn)的JMFD70×30 型；常規(guī)化學(xué)法測定所用儀器主要是德國Bran Luebbe 公司生產(chǎn)的AA3 型連續(xù)流動分析儀.化學(xué)試劑如硫酸、H2O2、NaOH、酒石酸鈉、水楊酸鈉、硝普鈉等均為分析純.

1.2 試驗方法

1.2.1 近紅外法 近紅外法在小麥各品質(zhì)參數(shù)的測定上應(yīng)用較早[5],近紅外測定儀更新?lián)Q代也比較快,測定的準確度也在不斷提高.本研究采用波通公司推出的第三代近紅外光譜測定儀（DA7250 型）進行蛋白質(zhì)含量測定.DA7250 型近紅外測定儀測定小麥整粒種子的具體操作方法為：開機完成自檢后點擊“分析”按鈕,再選擇要分析的產(chǎn)品“wheat”,接著將小麥籽粒樣品倒入樣品盤,輕震使籽粒填滿樣品盤,用透明直尺將超過樣品盤的部分刮出來,最后將樣品盤放置在DA7250 的磁力盤上,點擊“分析“按鈕開始分析.樣品ID 可以自動添加或用戶手動添加.只需要數(shù)秒鐘即可完成一個樣品的分析,相關(guān)數(shù)據(jù)會自動保存?zhèn)溆?

1.2.2 常規(guī)化學(xué)法

（1）樣品的準備與消解.待測小麥樣品用近紅外儀測定后用同一個磨粉機進行制粉,該磨粉機配備的網(wǎng)篩孔徑為250 μm（約為60 目）,所制面粉樣品符合GB/T 5506、GB/T 2057 等相關(guān)要求.將待測小麥面粉樣品在烘箱中105 ℃烘干3 h,采用凱氏法處理面粉-硫酸與雙氧水消解.秤取待測樣品0.100 0±0.001 0 g,加入5 mL 硫酸進行消解,然后用去離子水定容至100 mL.每個樣品設(shè)置一組3 個重復(fù),每6 個樣品設(shè)置一組空白試驗,即不添加面粉樣品,只加入5 mL 硫酸相同方法消解后定容至100 mL,搖勻后轉(zhuǎn)移至離心管備測.

（2）AA3 型流動分析儀試劑配制.采用AA3 型連續(xù)流動分析儀進行消解后樣品的N 含量測定,再根據(jù)小麥中的換算系數(shù),折算成蛋白質(zhì)含量.所需要配制的相關(guān)藥品及方法分別為：

緩沖溶液：35.8 g Na2HPO4·12H2O,44.5 g NaOH,50 g 酒石酸鈉,溶于去離子水中,定容至1 000 mL；

水楊酸：稱取40 g 水楊酸鈉,1 g 硝普鈉（Na2[Fe（CN）5NO]·2H2O）,溶入去離子水并定容至1 000 mL；

NaClO：量取質(zhì)量分數(shù)為5.25%的NaClO 溶液3 mL 定容至100 mL；

樣品清洗液：量取硫酸40 mL 使用去離子水定容至1 000 mL.

（3）AA3 型流動分析儀測定.標準溶液的制備：用100 mL 容量瓶將質(zhì)量濃度為1 000 mg/L 的銨態(tài)氮標準溶液與樣品同等酸度硫酸溶液混合,配制質(zhì)量濃度為0、1、2、5、10、20 和30 mg/L 的標準溶液.在測定前用流動分析儀測得標準曲線,以此為標準由吸光度值獲得相應(yīng)的質(zhì)量濃度.

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 主要采用Microsoft Excel 2010 進行相關(guān)數(shù)據(jù)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種蛋白質(zhì)含量測定方法的相關(guān)性分析

不同筋度小麥品種的兩種蛋白質(zhì)含量測定方法的相關(guān)性見表1.

表1 不同筋度小麥品種的兩種蛋白質(zhì)含量測定方法的相關(guān)性Tab.1 Correlation between two methods for determination of protein content in wheat cultivars with different gluten levels

由表1 可知,不論生態(tài)間還是年際間,常規(guī)化學(xué)法和近紅外法兩者測定結(jié)果總體上看都是極顯著相關(guān)；但根據(jù)品質(zhì)指標分成不同筋度類型后進行相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)主要是強筋品種的相關(guān)性在年際間、生態(tài)間都極顯著.這暗示在強筋小麥品種蛋白質(zhì)含量檢測上兩種方法檢測結(jié)果變化趨勢相同,即不同生態(tài)地區(qū)進行強筋小麥育種時,可以用近紅外檢測法對后代群體的蛋白質(zhì)含量進行快速無損檢測,能夠節(jié)省大量人力、物力,有助于加快強筋小麥育種進程,滿足生產(chǎn)上人們消費水平的提高對小麥高品質(zhì)品種的需求.而中筋小麥由于兩者相關(guān)性不穩(wěn)定,育種上應(yīng)用近紅外檢測雜交后代的蛋白質(zhì)含量時僅供參考,需要在后續(xù)種子量較大的世代進行化學(xué)法精確測定.

2.2 不同小麥品種兩種測定方法蛋白質(zhì)含量的相關(guān)性回歸方程

不同生態(tài)點、不同筋度類型小麥品種兩種測定方法所得蛋白質(zhì)含量的相關(guān)性回歸方程見圖1、圖2.

圖1 陜西生態(tài)點不同筋度小麥品種的兩種測定方法所得蛋白質(zhì)含量的相關(guān)性Fig.1 The correlation between the two methods for protein content assayamong differentwheat cultivars with different gluten qualitygrown inShaanxi province

圖2 河南生態(tài)點不同筋度小麥品種的兩種測定方法所得蛋白質(zhì)含量的相關(guān)性Fig.2 The correlation between the two methods for protein content assayamong differentwheat cultivars with different gluten qualitygrown in Henan province

由圖1 和圖2 可知,不同生態(tài)點、不同年度均表現(xiàn)為近紅外法測定結(jié)果高于化學(xué)法,強筋小麥化學(xué)法測定蛋白質(zhì)含量平均值為11.07%,近紅外法為15.18%,這與兩種方法測定樣品狀態(tài)不同有關(guān),化學(xué)法所測為面粉樣品,近紅外法所測為整粒種子.按照面粉蛋白占整粒種子蛋白的85%計算,推導(dǎo)出的強筋小麥平均種子蛋白含量約為13.02%（11.07/0.85）,比近紅外法測定結(jié)果的平均值低了約2 個百分點,這與李冬梅等[10]的研究結(jié)果比較接近.本研究發(fā)現(xiàn),強筋小麥品種的兩種測定方法雖然所測樣品狀態(tài)不同,但其相關(guān)性不管是年際間還是生態(tài)間都是極顯著的,這為育種領(lǐng)域、糧食收儲或加工領(lǐng)域的實際應(yīng)用提供了一定的參考.本研究不同生態(tài)點、不同年度所有強筋小麥品種兩種測定方法的相關(guān)性回歸方程為：y=0.607 3x+8.452 5（其中x 為化學(xué)法所測值,y 為近紅外法所測值,R2=0.606 2,r=0.778 6**）,所以可以根據(jù)該方程方便地計算出近紅外法測定結(jié)果所對應(yīng)的化學(xué)法預(yù)測值.經(jīng)本研究所得數(shù)據(jù)測算,預(yù)測值與化學(xué)法實測值的差值占后者的比例為10.55%,也就是預(yù)測值的準確度大約為90%.對于中筋品種來說,不同生態(tài)點、不同年度總體來看,化學(xué)法測定蛋白質(zhì)含量平均值為9.73%,近紅外法為14.13%,兩者差值與強筋小麥接近,但由于中筋小麥相對于強筋小麥來說不同生態(tài)點、不同年度兩種測定方法的相關(guān)性均較差,因此在蛋白含量測定上,無損、快速檢測的近紅外法對中筋小麥品種參考價值一般.

3 結(jié)論與討論

近紅外光譜測定法作為一種無損、快速、高效的現(xiàn)代分析技術(shù)目前已經(jīng)在包括農(nóng)業(yè)在內(nèi)的許多重要行業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用[10-12].李冬梅等[13]研究認為8620、DA7200 兩種型號的近紅外儀在小麥面粉蛋白含量測定上都與傳統(tǒng)的凱氏定氮法存在顯著相關(guān),可以應(yīng)用這些近紅外儀對小麥面粉蛋白質(zhì)進行測定,并認為在F2 代性狀分離的大量后代群體中可以運用DA7200 型近紅外儀對個體的少量粉樣測定進行早期預(yù)測.該研究沒有根據(jù)不同小麥品種的品質(zhì)差異進行分類分析.本研究發(fā)現(xiàn),總體上兩種蛋白質(zhì)含量測定方法的相關(guān)分析所得結(jié)論與李冬梅等的結(jié)果是一致的,但進行不同筋度分類分析后發(fā)現(xiàn),不同生態(tài)地區(qū)常規(guī)化學(xué)法和近紅外法的相關(guān)性上,均是強筋小麥中極顯著相關(guān),而在中筋小麥中相關(guān)性不穩(wěn)定.這暗示強筋小麥的蛋白質(zhì)含量主要是受基因型控制,受環(huán)境影響較小,而中筋小麥在蛋白質(zhì)含量上受環(huán)境影響較強筋小麥大[14].這與魏益民等[15]的研究結(jié)果基本一致.魏益民等對陜西省關(guān)中小麥品種區(qū)域試驗的12 個小麥品種（品系）在12 個試點的數(shù)據(jù)資料進行了相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)基因型與環(huán)境互作、環(huán)境效應(yīng)都對蛋白質(zhì)含量影響較小,而基因型效應(yīng)對包括蛋白質(zhì)含量在內(nèi)的所有品質(zhì)參數(shù)均有顯著影響.

隨著光譜技術(shù)、化學(xué)計量技術(shù)、計算機技術(shù)等快速發(fā)展,近紅外光譜測定儀也在不斷進行更新?lián)Q代.本研究采用波通公司推出的第三代近紅外光譜測定儀——DA7250 型,對近紅外光譜儀在不同小麥品種蛋白質(zhì)含量快速、無損的檢測進行了效果評價.研究結(jié)果證實,不同生態(tài)地區(qū)進行強筋小麥育種時可以用近紅外檢測法對雜交后代群體的蛋白質(zhì)含量進行快速、無損檢測,對小麥新品種培育,尤其是優(yōu)質(zhì)強筋小麥品種培育中品質(zhì)分析方法選擇具有一定參考價值.