汪端華 楊建國 李倩 吳雙花 何長征 馬艷青

摘 要： 南瓜銀葉突變體48a是在嫩食型中國南瓜中分離篩選到的穩(wěn)定遺傳自交系，銀色葉不僅可以作為標(biāo)記性狀應(yīng)用到育種中，還可為南瓜抗蟲、抗病、耐寒等一系列研究提供重要的材料基礎(chǔ)。筆者對銀葉突變體的表型特征及葉片的解剖結(jié)構(gòu)進行鑒定分析，發(fā)現(xiàn)植株整體長勢、熟性與野生型無明顯差異;成熟葉片正面全部呈銀灰色，葉綠素含量明顯降低，葉片上表皮細胞與柵欄細胞間明顯剝離，存在明顯的空隙。利用突變體48a和野生型49a南瓜自交系構(gòu)建的六世代遺傳群體，調(diào)查發(fā)現(xiàn)F2的綠葉與銀葉符合3∶1的分離比，回交群體BC1P1分離比符合1∶1，表明南瓜銀色葉性狀由單隱性基因控制。

關(guān)鍵詞：南瓜; 銀葉突變體; 表型特征; 遺傳學(xué)分析

中圖分類號：S642.1? ?文獻標(biāo)志碼：A? ?文章編號：1673-2871（2020）04-012-05

Abstract： Pumpkin silver leaf mutant 48a is a stable genetic inbred line isolated from tender pumpkin （Cucurbita moschata Duch.），which can be used not only as a marker trait in breeding， but also provide a series of important information such as insect resistance， disease resistance， cold tolerance. In this study， the phenotypic characteristics of silver leaf mutants and the anatomical structure of the leaves were identified， and we found that there was no significantly difference on growth and maturity between mutant 48a and wild type， but the content of chlorophyll was significant decreased and a clear gap exsisted between the upper epidermal cells and the fence cells in mutant 48a. From analysis of the sixth-generations group builded by mutant 48a and wild-type， the result shows that F2 green leaves and silver leaves was 3∶1 separation ratio， and 1∶1 separation ratio between the backcross population BC1P1， indicated that silver leaf traits were controlled by single recessive gene.

Key words： Pumpkin; Silver leaf mutant; Phenotypic characteristics; Genetic analysis

南瓜葉片銀斑是南瓜中的常見性狀，主要表現(xiàn)為葉脈的腋處帶銀白色斑紋，俗稱“銀斑葉”，是受單個顯性基因控制的一種斑紋[1-3]，區(qū)別于煙粉虱Bemisia tabaci B型（又名銀葉粉虱B. argentifolii）誘發(fā)的葫蘆科作物葉片正面全部呈銀白色的銀葉病[4-5]。2016年筆者在嫩食型中國南瓜資源中分離出1株完全銀色葉突變體，自交后5代后形成可遺傳的穩(wěn)定銀葉自交系，同時在同一材料中分離出穩(wěn)定的普通綠葉自交系，田間種植觀察發(fā)現(xiàn)銀斑葉南瓜具有很好的避蚜和抗病毒病的效果，這為南瓜抗蟲育種提供了新的思路。筆者對銀葉突變體的表型特征、葉片解剖結(jié)構(gòu)進行了鑒定分析，并構(gòu)建了銀葉六世代遺傳群體進行遺傳學(xué)分析，為后續(xù)的南瓜銀色葉基因定位和避蚜上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

在嫩食型中國南瓜材料的自交后代中，分離出具有完全銀葉的突變體48a和普通綠葉野生型材料49a，經(jīng)過5代自交，形成穩(wěn)定的自交系。以突變體48a和野生型49a為親本，構(gòu)建六世代遺傳群體，2018年4月將銀葉南瓜親本P1、綠葉南瓜親本P2、F1、F2、BC1P1、BC1P2種子同時種于湖南省蔬菜研究所高橋試驗田中。種子采用穴盤育苗，幼苗生長至3～4片真葉時定植，株行距50 cm×100 cm人字架栽培，進行統(tǒng)一的肥水管理，用于銀葉和綠葉南瓜農(nóng)藝學(xué)性狀調(diào)查和銀葉性狀的遺傳學(xué)分析。

1.2 方法

1.2.1 突變體48a的表型及農(nóng)藝性狀觀察 突變體48a在苗期即可觀察到明顯的銀葉表型，定植后到成株期都為銀葉表型，6月中旬成株期，對主蔓長、主蔓粗、葉片長度、葉片寬度、葉柄長等生物學(xué)性狀進行調(diào)查;同時在生育期內(nèi)對其始花期（小區(qū)內(nèi)50%植株開花的時期）、雌花數(shù)量進行調(diào)查，本試驗分別調(diào)查測量了突變體和野生型南瓜材料各10株。

1.2.2 遺傳學(xué)分析方法 定植后30 d左右，分別統(tǒng)計雙親、F1、F2、BC1P1、BC1P2等世代各群體銀色葉和綠色葉的植株數(shù)量，然后通過卡平方測驗，分析控制南瓜銀葉性狀基因的遺傳特性。

1.2.3 葉綠素含量測定方法 待植株生長到成苗期，定植后30 d左右，分別取突變體48a和野生型49a的頂端嫩葉和相同位置的成熟葉片用于檢測葉綠體色素含量。參考Arnon法[6]，具體如下：隨機稱取葉片0.1 g，剪碎，裝入15 mL帶塞的玻璃試管中，加入10 mL的80%丙酮，黑暗浸泡24 h，至組織發(fā)白。將提取液在島津公司的 UV-1800分光光度計上測定663、645、470 nm波長的OD值，計算Ca、Cb、Cx·c和CT（mg·L-1），公式如下：

Ca=12.21×OD663-2.81×OD645;

Cb=20.13×OD645-5.03×OD663 ;

Cx·c=（1 000×OD470-3.27×Ca-104×Cb）/229;

CT=Ca + Cb。

式中，Ca、Cb和CT分別表示葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素濃度;Cx·c為類胡蘿卜濃度，按下式計算組織中各色素含量。

葉綠體色素含量（mg·g-1）=（色素濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)）/樣品鮮質(zhì)量。

1.2.4 葉片解剖學(xué)觀察方法 定植后30 d左右，選取生長一致的突變體48a和野生型49a植株相同部位的成熟葉片，用于葉片解剖學(xué)觀察。首先用FAA固定液固定，番紅-固綠染色，RM2016病理切片機進行切片，切片放入干凈的二甲苯透明5 min，中性樹膠封片，NIKON ECLIPSE E100光學(xué)顯微鏡鏡檢，NIKON DS-U3成像系統(tǒng)進行圖像采集分析。用測微尺測量葉片橫截面的厚度、上下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度，葉片結(jié)構(gòu)緊密度（CTR）、疏松度（SR）的計算，參考田麗波等[7]的方法。

CTR/% =（柵欄組織厚度/葉片厚度）×100;

SR/%=（海綿組織厚度/葉片厚度）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體48a的表型與農(nóng)藝性狀分析

突變體48a和野生型49a進行表型對比觀察。子葉期，銀葉突變體和綠葉野生型子葉均表現(xiàn)為正常的綠色，子葉顏色無明顯差別;但進入真葉期，突變體48a長出真葉為綠色，帶明顯銀斑（圖1-A），隨著真葉逐漸長大，葉正面銀灰色逐漸加深，植株長大成熟后，葉片正面全部為銀灰色（圖1-B、C、E），背面仍為綠色（圖1-D）。

由成熟期的田間比較（圖1-B）可以看出，除了葉色有明顯區(qū)別外，突變體48a與野生型49a南瓜整體長勢和熟性差別不大，對兩者農(nóng)藝性狀測量數(shù)據(jù)顯示，兩者的始花期、葉長、葉寬等指標(biāo)無明顯差異。其中突變體48a南瓜主蔓長度（335.43±14.50）cm，比野生型49a低8.94%，而突變體48a主蔓粗度（1.19±0.03）cm，比野生型49a高4.39%，整體長勢與野生型49a差別不大（表1）。

2.2 遺傳學(xué)分析

構(gòu)建六世代遺傳群體，用目測分級的方法探究南瓜葉顏色的遺傳規(guī)律，F(xiàn)1為綠葉、卡平方檢驗結(jié)果表明F2綠葉與銀葉符合3∶1的分離比，回交群體BC1P1分離比符合1∶1，BC1P2植株葉顏色全為綠色， 南瓜銀色葉性狀符合1對顯一隱性基因的分離規(guī)律，為完全隱性遺傳（表2）。

2.3 葉綠素含量分析

由圖2可以看出，突變體48a與野生型49a間葉綠素相比，葉片葉綠素含量明顯減低，但嫩葉與成熟葉間的葉綠素?zé)o明顯差別。從成熟葉來看，突變體48a葉片中，葉綠素和類胡蘿卜素含量均顯著低于野生型葉片，其中葉綠素含量的變化主要由于葉綠素a含量變化導(dǎo)致，葉綠素b含量相對于綠葉野生型葉片無明顯差異。

2.4 突變體48a解剖學(xué)特征

從葉片橫切面可見（圖3-A）銀葉突變體48a葉片的上表皮細胞與柵欄組織、下表皮細胞與海綿狀組織之間有明顯的空隙，其中上部空隙更大。從圖3-B 可見綠葉野生型49a葉片的上表皮細胞與柵欄細胞，下表皮細胞與海綿狀的葉肉細胞之間連接緊密，沒有明顯的空隙。

對突變體48a與野生型49a的葉片厚度、表皮細胞厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度進行測量（表3），結(jié)果表明，突變體48a海綿組織厚度（44.2±3.00） μm，顯著低于野生型49a，葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度等指標(biāo)兩者間無顯著性差異，通過測算，突變體48a葉片結(jié)構(gòu)緊密度（CTR）32.06%，顯著高于野生型49a，葉片葉片結(jié)構(gòu)疏松度（SR）40.11%，顯著低于野生型49a（表3）。

3 討 論

突變體48a的銀色葉可能是葉片結(jié)構(gòu)變化所致，一般葉斑/片顏色變化產(chǎn)生原因主要分兩類，色素的變化（葉綠素/花青素等）和葉片結(jié)構(gòu)的變化（表皮細胞/空隙結(jié)構(gòu)）。前人研究普遍認為銀斑是葉片結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的，由于上表皮組織與柵欄組織之間的空隙，使光線達到綠色組織時候發(fā)生二次反射，在葉片上表皮形成多邊形的光反射，而不是正常綠葉上皮細胞形成的白色點狀光反射，使得葉片呈現(xiàn)偏灰白色，即銀色的葉片/葉斑[8-10]。本研究結(jié)果表明，銀葉突變體48a的葉綠素含量比野生型49a雖有顯著降低，但也不會造成葉面顯示銀灰色，從突變體48a葉片解剖學(xué)特征顯示，上表皮細胞與柵欄組織、下表皮細胞與海綿狀組織之間有明顯的空隙，其中上部空隙更大，這與張慧杰、張站備等[11-12]對西葫蘆銀斑研究一致，但他們的研究主要是基于西葫蘆銀葉病的葉片結(jié)構(gòu)，突變體48a與西葫蘆銀葉病葉片在結(jié)構(gòu)上雖然相似，但西葫蘆銀葉病會造成植株長勢弱、植株矮小、生長點皺縮等特征[4]，而突變體48a與野生型49a相比，除葉片呈銀灰色外，植株整體長勢正常，與野生型差別不大。所以突變體48a葉綠素含量明顯減低，但長勢正常的原因值得進一步研究。

銀葉突變體48a的銀葉表型為單基因的隱性遺傳，與Lopez-Anido等[13]研究結(jié)果一致，他們在西洋南瓜和中國南瓜雜交后代中發(fā)現(xiàn)了1個完全銀葉，研究表明由隱性基因grl控制。而Coyne[14]和Paris[15]等研究認為，南瓜銀斑葉受M基因的顯性遺傳，且認為影響銀葉性狀變異的主要因素有3個，（1）細胞結(jié)構(gòu)：V基因作用最強的部位是位于葉脈的腋處的細胞。（2）修飾基因：影響了M基因的時空表達。（3）包括溫度/干旱在內(nèi)的環(huán)境因素。據(jù)筆者田間試驗表明，突變體48a的銀葉性狀，不受環(huán)境影響，在不同季節(jié)、不同環(huán)境下種植均顯示完全銀葉，也不受時空表達影響，在全生育期內(nèi)均顯示銀色葉。目前南瓜的基因組測序已經(jīng)完成[16]，下一步擬利用全基因組混池測序的方法，進行銀葉基因的快速定位，為后續(xù)研究該基因在南瓜中的作用機理奠定基礎(chǔ)。

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