郭海燕，邢志華，王麗麗，解菊芬

1)山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院臨床系內(nèi)科學(xué)教研室 山西汾陽 032200 2)山西省汾陽醫(yī)院內(nèi)分泌科 山西汾陽 032200 3)山西省汾陽醫(yī)院血液內(nèi)科 山西汾陽 032200

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者生命健康。研究[1]顯示，高糖可誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡和氧化損傷，這也是DN發(fā)生發(fā)展的機制之一。因此，抑制腎小管上皮細胞凋亡和氧化應(yīng)激對于治療DN或延緩DN發(fā)展具有重要意義。生長分化因子15(growth differentiation factor 15，GDF15)是一個分泌蛋白，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β家族成員，參與心腦血管疾病、腫瘤等的發(fā)生發(fā)展[2-3]。有研究[4]顯示，GDF15可能通過上調(diào)磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B的表達，拮抗過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡。姚新豐[5]報道稱，GDF15在DN患者血清中表達升高，診斷DN的敏感度為82.2%，特異度為70.2%，可作為診斷DN的生物學(xué)指標(biāo)。但目前，GDF15基因?qū)δI小管上皮細胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響還未知。本研究首先檢測了DN患者腎組織中GDF15蛋白表達水平，然后以人腎小管上皮細胞HK-2為研究對象，探討了沉默GDF15基因表達對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響，以期為DN的分子靶向治療提供一定的思路。

1 對象與方法

1.1研究對象選取2017年12月至2018年5月于山西省汾陽醫(yī)院腎內(nèi)科住院并行腎活檢確診的16例DN患者為研究對象，其中男5例，女11例，年齡39～67(53.5±5.9)歲。以同期16例手術(shù)治療的腎癌患者的癌旁正常組織為對照，其中男9例，女7例，年齡42～69(56.3±7.5)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意，患者自愿簽署知情同意書。

1.2細胞和實驗試劑人腎小管上皮細胞株HK-2(中國科學(xué)院上海細胞庫)，胎牛血清(FBS)和低糖DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，四甲基噻唑藍(MTT)和胰蛋白酶(美國Sigma公司)，Lipofectamine 2000試劑盒(美國Invitrogen公司)，膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細胞凋亡試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白檢測試劑盒和2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)探針(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，兔抗人Bcl-2、Bax和GDF15多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，兔抗人Nrf2和血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)多克隆抗體(美國Abcam公司)，GDF15的小干擾RNA及亂序無義陰性序列(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，活性氧簇(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 復(fù)蘇HK-2細胞，加入含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，于2.5 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5 %CO2、97 %濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d更換一次新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)細胞生長融合至80%左右時，吸棄培養(yǎng)基。加入PBS清洗細胞后，加入2.5 g/L胰蛋白酶溶液消化，傳代培養(yǎng)。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染及效果評價 對數(shù)生長期的HK-2細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1×105個。當(dāng)細胞融合至60%時，參照Lipofectamine 2000試劑盒操作說明，分別將GDF15的小干擾RNA(si-GDF15組)及亂序無義陰性序列(si-NC組)轉(zhuǎn)染至HK-2細胞。轉(zhuǎn)染12 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞。Western blot法檢測兩組細胞中GDF15蛋白水平，評價轉(zhuǎn)染效果。

1.3.3 細胞分組及處理 將HK-2細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1×104個，分為對照組(細胞正常培養(yǎng)48 h)、高糖組(用含25 mmol/L[6]葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基作用48 h)、si-GDF15+高糖組和si-NC+高糖組(轉(zhuǎn)染si-GDF15和si-NC的細胞均用含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h)。每組均設(shè)9個復(fù)孔。

1.3.4 Western blot法檢測各組組織和細胞中GDF15蛋白表達 細胞分組和處理同1.3.3。細胞培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化收集細胞。RIPA蛋白裂解液提取組織和各組細胞中總蛋白，BCA法對蛋白進行定量。取適量蛋白，100 ℃煮沸5 min，變性后，每孔30 μg上樣行PAGE電泳。電泳后，濕轉(zhuǎn)至聚偏乙烯二氟膜，于50 g/L脫脂牛奶液中封閉2 h。加入GDF15抗體(按1∶600稀釋)，4 ℃孵育過夜。洗膜后，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(按1∶200稀釋)，37 ℃孵育1 h。洗膜后，加入ECL，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。以GAPDH為內(nèi)參，用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3.5 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率 細胞分組和處理同1.3.3。PBS清洗細胞，加入適量2.5 g/L胰蛋白酶消化，收集細胞。取1.0×106個細胞，PBS清洗后，加入400 μL結(jié)合緩沖液輕輕吹打；加入10 μL Annexin V-FITC，避光孵育10 min；加入5 μL PI室溫孵育5 min；再加入100 μL結(jié)合緩沖液，混勻后上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3.6 各組細胞內(nèi)ROS含量檢測 細胞分組和處理同1.3.3。細胞培養(yǎng)結(jié)束后，按照ROS試劑盒說明書，吸棄培養(yǎng)基，加入按1∶500稀釋后的DCFH-DA，37 ℃孵育40 min；用無血清培養(yǎng)基清洗細胞3次，胰蛋白酶消化，PBS清洗。PBS重懸細胞，用多功能酶標(biāo)儀檢測(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm)ROS含量。

1.3.7 各組細胞內(nèi)MDA、SOD和GSH-Px水平檢測細胞分組和處理同1.3.3。細胞培養(yǎng)結(jié)束后，用胰蛋白酶消化，PBS清洗、收集。用細胞裂解液裂解細胞，保留上清液，分別參照MDA、SOD和GSH-Px試劑盒說明書檢測上清中MDA、SOD和GSH-Px水平。

1.3.8 各組細胞中Bcl-2、Bax、Nrf2和HO-1蛋白表達的Western blot法檢測 細胞分組和處理同1.3.3。檢測方法同1.3.4。其中Bcl-2抗體按1∶400稀釋，Bax抗體按1∶400稀釋，Nrf2抗體按1∶600稀釋，HO-1抗體按1∶600稀釋。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用Excel和PEMS 3.2進行數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用兩獨立樣本t檢驗比較正常腎組織和DN患者腎組織中GDF15蛋白表達的差異，應(yīng)用單因素方差分析和SNK-q檢驗比較各組細胞凋亡率、各組細胞中GDF15、Bcl-2、Bax、Nrf2和HO-1蛋白表達以及ROS含量、MDA、SOD和GSH-Px水平的差異。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1正常腎組織和DN患者腎組織中GDF15蛋白表達的比較見圖1。與正常腎組織(0.45±0.04)比較，DN患者腎組織(0.81±0.07)中GDF15蛋白表達水平升高(t=17.861，P<0.001)。

1：正常腎組織；2：DN患者腎組織

2.2高糖對HK-2細胞GDF15蛋白表達的影響見圖2。與對照組(0.43±0.02)比較，高糖組HK-2細胞(0.87±0.05)中GDF15蛋白表達水平升高(t=24.512，P<0.001)。

1：對照組;2：高糖組

2.3GDF15小干擾RNA轉(zhuǎn)染效果驗證結(jié)果見圖3。與si-NC組(0.45±0.05)比較，si-GDF15組(0.19±0.03)HK-2細胞中GDF15蛋白表達水平降低(t=13.377，P<0.001)。

1：si-NC組；2：si-GDF15組

2.4沉默GDF15表達對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞凋亡的影響見圖4。高糖組HK-2細胞凋亡率高于對照組(P<0.05)。si-GDF15+高糖組HK-2細胞凋亡率低于si-NC+高糖組(P<0.05)。高糖組與si-NC+高糖組細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.5沉默GDF15表達對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞氧化應(yīng)激的影響見表1。由表1可知，與對照組比較，高糖組和si-NC+高糖組MDA和ROS水平升高(P<0.05)，SOD和GSH-Px水平降低(P<0.05)。與si-NC+高糖組比較，si-GDF15+高糖組MDA和ROS水平降低(P<0.05)，SOD和GSH-Px水平升高(P<0.05)。高糖組與si-NC+高糖組比較，各檢測指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1：對照組；2：高糖組；3：si-NC+高糖組；4：si-GDF15+高糖組。*：與對照組比較，P<0.05；#：與si-NC+高糖組比較，P<0.05

圖4 沉默GDF15表達對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞凋亡率的影響

表1 各組HK-2細胞中MDA、ROS、SOD和GSH-Px水平的變化(n=9)

*：與對照組比較，P<0.05； #：與si-NC+高糖組比較，P<0.05

2.6沉默GDF15表達對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響見圖5和表2。高糖組和si-NC+高糖組HK-2細胞中Bax蛋白水平高于對照組(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平低于對照組(P<0.05)。si-GDF15+高糖組HK-2細胞中Bax蛋白水平低于si-NC+高糖組(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平高于si-NC+高糖組(P<0.05)。高糖組與si-NC+高糖組Bax和Bcl-2蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1：對照組；2：高糖組；3：si-NC+高糖組；4：si-GDF15+高糖組

圖5 沉默GDF15對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達影響

*：與對照組比較，P<0.05； #：與si-NC+高糖組比較，P<0.05

2.7沉默GDF15表達對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)蛋白表達的影響見圖6和表3。高糖組和si-NC+高糖組細胞質(zhì)Nrf2蛋白水平低于對照組(P<0.05)，HO-1和細胞核Nrf2蛋白水平高于對照組(P<0.05)。si-GDF15+高糖組HO-1和細胞核Nrf2蛋白水平高于si-NC+高糖組(P<0.05)，細胞質(zhì)Nrf2蛋白水平低于si-NC+高糖組(P<0.05)。高糖組與si-NC+高糖組HO-1和細胞核Nrf2蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1：對照組；2：高糖組；3：si-NC+高糖組；4：si-GDF15+高糖組

圖6 沉默GDF15對高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞Nrf2和HO-1蛋白表達的影響

*：與對照組比較，P<0.05； #：與si-NC+高糖組比較，P<0.05

3 討論

隨著人們飲食習(xí)慣的改變，糖尿病的發(fā)病率呈現(xiàn)增長的趨勢，DN作為糖尿病的常見并發(fā)癥被廣泛關(guān)注。腎小管上皮細胞是腎臟的固有細胞之一，在葡萄糖、炎性因子、缺氧等因素誘導(dǎo)時會產(chǎn)生氧化應(yīng)激和凋亡，最終導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化，嚴(yán)重時導(dǎo)致腎功能衰竭[7]。因此，腎小管上皮細胞的凋亡和氧化應(yīng)激與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

GDF15是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，參與調(diào)控細胞凋亡[8]。研究[9]顯示，GDF15在DN患者血清中的水平明顯高于單獨糖尿病人群和健康人群，是影響DN的獨立危險因素。目前，還未見GDF15影響腎小管上皮細胞凋亡和氧化應(yīng)激的相關(guān)報道。本研究首先檢測了DN患者腎組織中GDF15蛋白表達水平，結(jié)果顯示，GDF15蛋白在DN患者腎組織中呈高表達，提示GDF15可能參與DN的發(fā)生發(fā)展。進一步使用高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細胞HK-2后，細胞中GDF15蛋白表達水平升高；通過轉(zhuǎn)染GDF15小干擾RNA沉默GDF15表達后，高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞凋亡率和Bax蛋白水平明顯降低，Bcl-2蛋白水平明顯升高，提示沉默GDF15基因表達可能通過調(diào)控Bax/Bcl-2蛋白表達抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞凋亡。

高糖環(huán)境下，腎小球細胞內(nèi)氧化作用增強，抗氧化與氧化平衡被打破，細胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS[10]。ROS進一步造成細胞膜脂質(zhì)過氧化，損傷細胞膜。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，可間接反映脂質(zhì)過氧化水平[11]。SOD是機體內(nèi)重要的抗氧化酶，可清除氧自由基，保護機體免受氧化損傷。GSH-Px也是一種抗氧化酶，可與SOD協(xié)同作用，減少活性氧自由基的產(chǎn)生，防止脂質(zhì)過氧化及其中間代謝產(chǎn)物對機體的損害，維持體內(nèi)的氧化和抗氧化平衡[12]。本研究顯示，高糖處理后HK-2細胞ROS和MDA水平升高，SOD和GSH-Px水平降低，說明高糖誘導(dǎo)HK-2細胞產(chǎn)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)。沉默GDF15基因表達后，高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞ROS和MDA水平降低，SOD和GSH-Px水平升高，提示沉默GDF15基因可減輕高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護細胞免受氧化損傷。

Nrf2/HO-1信號通路在細胞氧化應(yīng)激和凋亡中發(fā)揮重要作用，是機體內(nèi)重要的抗氧化信號通路[13]。正常生理條件下，Nrf2與其抑制蛋白Keap1在細胞質(zhì)中形成復(fù)合物。當(dāng)受到氧化應(yīng)激刺激時，Nrf2磷酸化與Keap1發(fā)生解離，并轉(zhuǎn)移至細胞核，進而啟動HO-1基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗氧化作用，保護細胞免受氧化損傷[14]。本研究顯示，沉默GDF15基因表達后，高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞HO-1和細胞核Nrf2蛋白水平明顯升高，細胞質(zhì)Nrf2蛋白水平明顯降低，提示沉默GDF15基因表達可激活Nrf2/HO-1信號通路，減輕高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞氧化應(yīng)激等損傷。

綜上所述，高糖可促進人腎小管上皮細胞HK-2中GDF15表達，沉默GDF15基因表達可減少高糖誘導(dǎo)的HK-2細胞凋亡、減輕氧化應(yīng)激，其可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路，保護HK-2細胞免受損傷，為DN的靶向分子治療提供了新思路。